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1、引物合成酶DnaG在原核生物的DNA復(fù)制中有著重要的調(diào)控作用,已有研究表明c-di-GMP和恥垢分枝桿菌的引物合成酶DnaG存在相互作用。但是它們的具體結(jié)合位點(diǎn)、互作機(jī)制及如何共同調(diào)控DNA復(fù)制的機(jī)理都還不清楚。本課題以恥垢分枝桿菌的引物合成酶DnaG為研究材料,從蛋白質(zhì)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)等方面對(duì)DnaG和c-di-GMP的互作機(jī)理進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下:
1.利用DnaG全長(zhǎng)和不同結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了19個(gè)原核載體并表達(dá),成功純化了11
2、6-630、121-460、116-440、461-636、477-630、121-630等結(jié)構(gòu)域,用于結(jié)晶。
2.通過(guò)生物信息學(xué)、不完全酶解及質(zhì)譜的手段,確定了DnaG中460-477這一段為無(wú)序結(jié)構(gòu),連接著TOPRIM結(jié)構(gòu)域和C端的解旋酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
3.優(yōu)化121-460的晶體,加入添加劑后,晶體衍射分辨率由7(A)提高到3.8(A)。但是數(shù)據(jù)還不夠好,不能解析結(jié)構(gòu),還需繼續(xù)優(yōu)化晶體。
4.表達(dá)并純化
3、YdeH-pET-28a,利用YdeH體外大量合成c-di-GMP。優(yōu)化合成及純化的工藝,目前可以達(dá)到在反應(yīng)3h后,GTP可以全部被合成為c-di-GMP。12mg YdeH可以合成1mg c-di-GMP。
5.利用合成的c-di-GMP與121-460共結(jié)晶,初篩長(zhǎng)出晶體,對(duì)晶體進(jìn)行優(yōu)化,但是分辨率不高,晶體優(yōu)化仍需繼續(xù)進(jìn)行。
本研究通過(guò)大量的蛋白表達(dá)和結(jié)晶嘗試,摸索出了DnaG蛋白純化和結(jié)晶的方法,并確定了Dn
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