c-di-AMP降解酶Rv2837c以及c-di-GMP調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子PA4878的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、細(xì)菌能準(zhǔn)確感知周圍環(huán)境條件如營養(yǎng)、壓力、溫度、滲透壓、PH等的變化并能充分進(jìn)行回應(yīng)，這種能力對細(xì)菌的生存至關(guān)重要。而在這個(gè)過程中起重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的是細(xì)菌的第二信使分子。近年來，環(huán)二核苷酸作為一類重要的第二信使分子被人們越來越廣泛認(rèn)知。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌體內(nèi)的環(huán)二核苷酸(c-di-GMP以及c-di-AMP)能調(diào)控包括細(xì)菌的移動(dòng)性、毒性、細(xì)菌大小、細(xì)胞壁穩(wěn)態(tài)以及生物被膜的形成等在內(nèi)的許多細(xì)菌的生理活動(dòng)，同時(shí)在感染宿主過程中能作為激活劑結(jié)合S

2、TING后誘導(dǎo)宿主Ⅰ型干擾素(IFNs)的應(yīng)答。
　　本論文第一部分主要對結(jié)核分枝桿菌中降解c-di-AMP的酶Rv2837c進(jìn)行結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及生理生化酶活分析。結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）屬于革蘭氏陽性菌，是引起結(jié)核病的胞內(nèi)病原菌，結(jié)核病至今仍為世界上重要的傳染病之一。到目前為止對于結(jié)核分枝桿菌的了解仍很有限，因此關(guān)于它的研究在結(jié)核病的預(yù)防以及治療性疫苗的研發(fā)中非常重要。和一些革蘭氏陽性病

3、原菌相似，結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)也存在c-di-AMP信號(hào)分子調(diào)控系統(tǒng)。CnpB（即Rv2837c）具有降解c-di-AMP的磷酸二酯酶活性，對結(jié)核分枝桿菌胞內(nèi)c-di-AMP水平的穩(wěn)定是必不可少的，同時(shí)cnpB的敲除菌株進(jìn)行感染巨噬細(xì)胞及活體小鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)，敲除菌株誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生比野生型增強(qiáng)了十倍，且感染小鼠的毒性減弱。同時(shí)Rv2837c作為單DHH-DHHA1結(jié)構(gòu)域蛋白，早在2012年就被報(bào)道作為NrnA家族蛋白可以發(fā)揮多種功能

4、:既可以作為Orn同源類蛋白降解nanoRNA（RNA oligos＜5nucleotides），又可以發(fā)揮CysQ功能將pAp去磷酸化生成AMP。Rv2837c對多種類型的底物都具有降解活性，且不同底物的降解速率不同。目前，Rv2837c對不同底物的具體降解機(jī)制并不清楚。論文本部分主要通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)、分子生物學(xué)及微生物學(xué)等多種實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合來解釋Rv2837c的降解機(jī)制。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:
　　（一）解析得到2.0(A)的R

5、v2837c晶體結(jié)構(gòu)，通過對結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析比較以及突變體酶活測定確定了酶活反應(yīng)需要兩個(gè)錳離子參與。和其同源蛋白的多序列比對也表明兩個(gè)錳參與降解反應(yīng)的機(jī)制是普遍存在的。
　　(二)解析得到2.3(A)的Rv2837c降解c-di-AMP反應(yīng)中間態(tài)的Rv2837c/pApA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。pApA作為c-di-AMP降解的中間產(chǎn)物，同時(shí)也屬于一類nanoRNA，這一復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的取得為Rv2837c降解nanoRNA類核苷酸小分子提

6、供了準(zhǔn)確、真實(shí)的降解模型。根據(jù)復(fù)合物結(jié)構(gòu)以及生化數(shù)據(jù)提出了簡單的Rv2837c水解磷酸二酯鍵的酶活反應(yīng)機(jī)制。
　　(三)測定了Rv2837c降解不同環(huán)二核苷酸(c-di-AMP、c-di-GMP、3，-5，cGAMP)以及線性二核昔酸(pGpG、pApA)的降解速率，明確了Rv2837c能特異識(shí)別并降解3'-5'磷酸二酯鍵。首次測定到Rv2837c能降解2'-5'cGAMP生成線性二核苷酸2'-5'-pGpA。
　　(四)通

7、過對c-di-AMP降解過程中底物及產(chǎn)物含量變化的實(shí)時(shí)檢測，以及c-di-AMP與pApA的酶活米氏曲線的測定，并結(jié)合動(dòng)力學(xué)公式計(jì)算，推導(dǎo)得出了Rv2837c降解c-di-AMP時(shí)需要第一步反應(yīng)的中間產(chǎn)物pApA在蛋白內(nèi)部進(jìn)行翻轉(zhuǎn)，接著在酶活中心進(jìn)行第二步水解反應(yīng)產(chǎn)生2個(gè)AMP。
　　（五）在敲除MSMEG-2630的恥垢分枝桿菌中以及MG1655中分別過表達(dá)Rv2837c蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)后測定胞內(nèi)c-di-AMP或c-di-GMP

8、濃度以及MG1655移動(dòng)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Rv2837c在體內(nèi)能降解c-di-AMP和c-di-GMP，且能通過c-di-GMP水平調(diào)控細(xì)菌的移動(dòng)性。通過細(xì)菌體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以及對結(jié)核分枝桿菌基因組分析，推測Rv2837c在M.tuberculosis中可能參與調(diào)控c-di-AMP、c-di-GMP兩條信號(hào)通路。
　　本論文第二部分主要對銅綠假單胞菌c-di-GMP調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子BrlR的晶體結(jié)構(gòu)以及生理功能進(jìn)行了研究。銅綠假單胞菌為革蘭氏

9、陰性菌，是醫(yī)院內(nèi)感染常見的條件致病菌，在燒傷菌血癥感染、泌尿道感染、肺部感染及術(shù)后傷口感染中都是重要的感染來源，且這些感染是無法根除的。銅綠假單胞菌能引起諸多類型的感染主要依賴于它強(qiáng)大的毒力因子系統(tǒng)。而在臨床抗感染治療困難的主要原因在于銅綠假單胞菌能對多種抗生素產(chǎn)生耐藥性。銅綠假單胞菌基因PA4878編碼的蛋白BrlR，同源性分析表明屬于MerR家族蛋白，僅在細(xì)菌生物被膜時(shí)表達(dá)且與生物被膜的耐藥性相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。隨后的研究表明B

10、rlR蛋白能結(jié)合并調(diào)控自身啟動(dòng)子以及mexA，mexE啟動(dòng)子激活外排泵的表達(dá)來增強(qiáng)細(xì)菌的耐藥性，但是作為MerR家族蛋白卻不受外排藥物分子激活，而是受到c-di-GMP的結(jié)合調(diào)控，且與c-di-GMP結(jié)合比例為2∶1。最初想通過結(jié)構(gòu)解析來了解c-di-GMP與BrlR的結(jié)合機(jī)制，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)BrlR是一個(gè)復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，受多種信號(hào)通路的調(diào)控。主要研究內(nèi)容和結(jié)論如下:
　　(一)解析得到3.1(A)的BrlR晶體結(jié)構(gòu)，

11、通過結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)BrlR蛋白三個(gè)獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上與同源蛋白相比非常保守，但N端與C端的相對位置發(fā)生了改變。且同源蛋白一般為二聚體形式并以二聚體發(fā)揮功能，而BrlR相比同源蛋白形成了不同的自我封閉式的四聚體構(gòu)型。
　　(二)BrlR獨(dú)特的四聚體構(gòu)型導(dǎo)致其N端HTH結(jié)構(gòu)域大部分被四聚體中另一亞基的C端結(jié)構(gòu)域堵塞，這預(yù)示著BrlR蛋白結(jié)合DNA的能力應(yīng)該很弱。隨后通過FP實(shí)驗(yàn)以及EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了體外時(shí)BrlR對DNA的弱結(jié)合。

12、
　　(三)解析得到2.5(A)的BrlR/c-di-GMP復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)BrlR的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域有兩個(gè)c-di-GMP結(jié)合位點(diǎn)。通過相關(guān)突變體生化實(shí)驗(yàn)，確定BrlR蛋白確實(shí)存在兩個(gè)c-di-GMP結(jié)合位點(diǎn)，且兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都有助于c-di-GMP促進(jìn)BrlR-DNA的結(jié)合。
　　(四)對結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析比較發(fā)現(xiàn)BrlR的C端存在保守的藥物結(jié)合口袋，尤其與同源蛋白SAV2435的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)非常相似，且BrlR蛋白以及BrlR

13、的C端結(jié)構(gòu)域(BrlR-C)都能結(jié)合EB分子，經(jīng)過與SAV2435/RH6G復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)比對以及相關(guān)突變體EB染色分析，確定了BrlR-C具有結(jié)合多種藥物分子的能力。利用SPR篩選結(jié)合的藥物分子，最終確定BrlR能特異性結(jié)合妥布霉素和慶大霉素等氨基糖苷類抗生素。
　　(五)由BrlR結(jié)合的藥物分子構(gòu)型，以及它可以結(jié)合EB等顏色小分子，推測其可能結(jié)合銅綠自身分泌的染料分子綠膿菌素(PYO)。通過SPR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)BrlR結(jié)合P