φC31整合酶及HIV整合酶的結構、功能初步解析.pdf

1、基因治療和轉基因研究中，利用定點整合酶有效地將目的基因位點特異性地整合到細胞基因組中，可以使目的基因獲得安全和長期的表達。ΦC31整合酶作為一個來源于鏈霉菌噬菌體的位點特異性整合酶，近年來它被廣泛應用于基因治療和轉基因研究中，但是和病毒載體相比，它存在一個效率較低的問題。來源于HIV的慢病毒載體系統(tǒng)為目前最廣泛使用的整合性病毒基因載體，但是HIV整合酶介導的隨機整合構成其基因治療應用安全性隱患。開發(fā)具備HIV整合酶整合效率和ΦC31整合

2、酶定點整合特點的轉基因體系，對基因治療研究有重大意義。本研究的基本目的是解析ΦC31整合酶特異性DNA識別結合能力的基礎，并探討細胞內蛋白質對HIV整合酶介導轉基因效率和基因表達的影響從而為研究整合酶的結構功能關系以及細胞蛋白對整合酶功能的影響，以及進一步設計和開發(fā)上述體系提供所必需的前期理論基礎。
　　本文首先研究了ΦC31整合酶C端的DNA結合功能域。酵母雙雜交的方法篩選到11個和ΦC31整合酶有相互作用的細胞蛋白，其中DAX

3、X通過結合ΦC31整合酶的451RFGK454抑制其活性。在此基礎上，我們研究了這些氨基酸對ΦC31整合酶活性的影響及影響機制。首先，在大腸桿菌中通過藍白斑方法檢測整合酶活性，結果表明:去除了451RFGK454的突變體活性下降非常明顯，只有野生型的4.52％±3.56％，而突變體R451H也只保留了42.03％±7.08％的活性，說明451RFGK454是ΦC31整合酶活性所必需的氨基酸。神經網絡方法、最近鄰居法以及卷曲螺旋分析提示氨

4、基酸407-517的二級結構符合Helix-Turn-Helix特征，可能為DNA結合基序。EMSA實驗表明:451RFGK454去除或第451位精氨酸突變成組氨酸后，ΦC31整合酶的DNA結合能力以及結合的特異性都大大下降，說明這四個氨基酸是影響整合酶對其底物特異性識別和結合的關鍵氨基酸。但是預測的DNA結合基序407-517卻沒有DNA結合能力，去除這個基序的ΦC31整合酶也沒有結合能力。可能原因是表達的407-517基序它沒有很好

5、地折疊成HTH的結構，圓二色譜方法證實了這一點，另一個原因可能是ΦC31整合酶本身結構和功能的復雜性造成的，它并非簡單地由某個單一的結構域來完成某項功能，一個功能的完成也可能不僅依賴于某個特定結構域，整個酶的各個結構域之間不是獨立的，而是互相協(xié)作的，407-517基序可能確實是負責特異性結合DNA的主要功能域，但是它單獨起作用無法完成識別和結合DNA這個過程，需要其它結構域的協(xié)助。
　　接下來我們研究了細胞內能夠和HIV-1整合酶

6、發(fā)生相互作用，抑制或促進慢病毒基因組整合和基因表達的蛋白。
　　最初發(fā)現(xiàn)過轉SUMO1/Ubc9、SUMO2/Ubc9能改變HIV-1 IN在細胞內的定位，由均勻彌散分布變?yōu)榧毎藘鹊念w粒狀分布，HIV-1IN可能被定位到了內源的PML核體上，HIV-1IN和PML的亞細胞定位實驗顯示兩者具有強烈的共定位，因此推想:過轉的SUMO1/Ubc9或SUMO2/Ubc9可能起到一個橋梁的作用，它們能和HIV-1IN發(fā)生相互作用并把它帶到

7、內源的PML核體上?；谶@個推測，我們進行了酵母配對實驗、亞細胞定位實驗和免疫共沉淀分析，證明HIV-1IN能和SUMO1、SUMO2、Ubc9發(fā)生直接相互作用，和PML之間發(fā)生間接作用。進一步的實驗證明HIV-1 IN能夠被SUMO1、SUMO2所共價修飾。最后我們考察了這些蛋白對慢病毒基因組的整合以及報告基因EGFP表達的影響。通過流式細胞儀檢測病毒感染后EGFP陽性細胞率來較粗略地表征慢病毒基因組的整合情況，結果發(fā)現(xiàn):單獨過轉Ub

8、c9時，EGFP陽性率由載體對照組的37.29％±7.54％下降到了25.21％±2.63％(p＜0.05)，而Ubc9和SUMO1同時過轉時，下降更明顯，陽性率為16.46±3.02％(p＜0.01)，有極其顯著性差異，Ubc9和SUMO2同時過轉時陽性率變?yōu)?2.89％±4.49％(p＜0.05)。Ubc9可以極大地抑制慢病毒基因組的整合，并且SUMO1和SUMO2存在時抑制作用加強，存在加和作用。此外，我們還采用了Alu-LTRR

9、eal-Time Nested PCR的方法檢測慢病毒整合，結果和前一種方法吻合。最后我們檢測了報告基因EGFP的平均熒光強度變化，結果和對照組相比，平均熒光強度都下降到了80％左右，引起這種平均熒光強度變化的因素是Ubc9，SUMO1或SUMO2存在時沒有加和作用。盡管本實驗證明PML蛋白對慢病毒感染并沒有抑制作用，但是PML-NB里的幾個主要組成型蛋白如sp100、DAXX等都對慢病毒感染具有不同程度的抑制作用，這幾個蛋白能夠被SU

10、MO化共價修飾或和SUMO有非共價相互作用，且都能夠和HIV-1IN發(fā)生直接的相互作用，結合本實驗的結果，我們提出了一個SUMO通路介導的PML-NBs抑制慢病毒感染的模型:HIV-1IN和Ubc9、SUMO直接結合，Ubc9是介導SUMO偶聯(lián)到它們底物上的關鍵酶，PML-NBs是一個高度SUMO化的結構，結合了IN的Ubc9-SUMO復合體通過和定位在PML-NB上的E3連接酶的相互作用，將SUMO偶聯(lián)到它的底物如sp100、Daxx

11、上，因此通過SUMO通路，HIV-1IN被捕獲到PML-NB上，另一方面，HIV-1IN自身能夠被SUMO1、SUMO2所共價修飾，SUMO化后的IN也能夠定位到PML核體上。核體里的蛋白如sp100、DAXX等和IN發(fā)生直接相互作用，進入下游信號通路，最終抑制慢病毒基因組的整合或基因表達，
　　綜上所述，本文初步解析了ΦC31整合酶C端的DNA結合功能域，找到了影響特異性DNA識別和結合的4個關鍵氨基酸，為利用ΦC31整合酶定點