2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、利用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)有效地將目的基因位點(diǎn)特異性地整合到哺乳動物細(xì)胞的基因組中,從而避免外源基因隨機(jī)插入基因組,這是基因治療和轉(zhuǎn)基因動物研究中未解決的重要問題。鏈霉菌噬菌體ΦC31整合酶可以將外源核苷酸序列定點(diǎn)整合到哺乳動物細(xì)胞基因組的特異性位點(diǎn)上,從而極大的降低了由于外源基因隨機(jī)插入造成的基因突變風(fēng)險,可以成為在哺乳動物細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)特異性重組操作和基因治療的有用工具?,F(xiàn)在常用的幾種基因轉(zhuǎn)移途徑,病毒載體由于隨機(jī)整合和免疫學(xué)性質(zhì),安全

2、性一直受到人們的質(zhì)疑。非病毒載體如裸DNh載體的轉(zhuǎn)移效率受不同細(xì)胞類型的影響,也有潛在的隨機(jī)整合外源基因到宿主基因組的可能性。近年來新出現(xiàn)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)能夠在幾乎不受細(xì)胞類型限制的條件下,轉(zhuǎn)移一個活性的蛋白進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞中,在體內(nèi)可以通過小鼠的血腦屏障,提示該技術(shù)可以作為一種新的基因轉(zhuǎn)移途徑在基因治療和轉(zhuǎn)基因動物研究中得到應(yīng)用。
   本文首先研究了ΦC31整合酶在體外的生物學(xué)特性。我們通過建立新的體外ΦC31酶的活性檢測系統(tǒng)

3、,表達(dá)純化了23.8U/mg的重組中ΦC31整合酶蛋白,它能夠在pH6.5-11,溫度9-37℃的條件下表現(xiàn)酶活性。在最適條件下(pH8.5,溫度20℃),ΦC31整合酶蛋白的Km和Vmax分別是6.261nmol/L和0.8621nM-1min-1。利用原子吸收質(zhì)譜分析(ICP-mass)發(fā)現(xiàn),ΦC31整合酶蛋白結(jié)合高濃度的K+離子,沒有發(fā)現(xiàn)結(jié)合Ca2+,Mg2+和Mn2+等金屬離子的特性。紅外傅立葉光譜(FT-IR)和圓二色儀(CD

4、)對該蛋白構(gòu)象的研究表明,蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋,β-折疊和無規(guī)則的卷曲的比例十分敏感地受pH值,溫度,離子濃度和酶的DNA底物等條件的影響。在一些蛋白酶的抑止劑(如EDTA,EGTA,2-ME,PMSF,DTT)和低濃度的去垢劑(如0.1%Tween20和TritonX-100)的條件下,該整合酶活性基本不受影響。以上研究表明ΦC31整合酶的性質(zhì)與已發(fā)現(xiàn)的入重組酶家族成員(如Cre重組酶)完全不同,是一種新型的絲氨酸重組酶。ΦC31

5、整合酶體外檢測系統(tǒng)的建立和酶動力學(xué)性質(zhì)的研究,將為后續(xù)的以該酶為代表的大分子量的絲氨酸整合酶家族的結(jié)構(gòu)和功能研究奠定基礎(chǔ)。
   在哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用ΦC31整合酶在基因轉(zhuǎn)移途徑上仍然需要考慮其有效性和安全性。蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)可以轉(zhuǎn)移一個不受細(xì)胞類型限制的外源蛋白進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞中,轉(zhuǎn)導(dǎo)后的蛋白在細(xì)胞中瞬時存在并表現(xiàn)生物活性。這一技術(shù)為有效地應(yīng)用ΦC31整合酶介導(dǎo)的定點(diǎn)整合提示了新的方向。為了建立ΦC31整合酶的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),我們構(gòu)

6、建了定量檢測ΦC31整合酶功能的哺乳動物的293-PB[EGFP]報告細(xì)胞系。流式細(xì)胞儀分析(FACS)和細(xì)胞免疫組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)證實(shí),我們制備的融合TAT-PTD(HIV-1的Tat蛋白的47-57aa的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域)的ΦC31整合酶蛋白能夠以密度依賴性的方式進(jìn)入所有與之共孵育的哺乳動物細(xì)胞中,并且有效地介導(dǎo)特異性核苷酸序列位點(diǎn)的精確重組反應(yīng)。至此,一個新的能夠在哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù),轉(zhuǎn)移ΦC31整合酶的方法體系得到了初步的

7、建立。
   我們從哺乳動物細(xì)胞中ΦC31整合酶的細(xì)胞定位與功能的研究入手,發(fā)現(xiàn)增加外源的ΦC31整合酶在細(xì)胞核內(nèi)的分布,能夠很好地增加該酶介導(dǎo)的細(xì)胞染色體水平的重組功能。為了更好在哺乳動物細(xì)胞中應(yīng)用ΦC31整合酶,我們用NLS(SV40大T抗原的核定位信號)對ΦC31整合酶蛋白的C端進(jìn)行了修飾。通過ΦC31整合酶分別以蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)和質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),證實(shí)C端融合NLS的ΦC31整合酶能夠在哺乳動物細(xì)胞中有更好的重組效果。

8、根據(jù)上述結(jié)果,我們利用TAT和NLS修飾的ΦC31整合酶(TAT-ΦC31-NLS)經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)人凝血因子Ⅸ(hFⅨ)基因特異性地整合到哺乳動物細(xì)胞基因組中,篩選得到的細(xì)胞系能夠長期高效表達(dá)hFIX蛋白,并且表現(xiàn)出大約50%的外源hFIX基因位點(diǎn)特異性地整合在細(xì)胞基因組的psiA位點(diǎn)。在細(xì)胞中的瞬時存在的TAT-ΦC31-NLS能夠介導(dǎo)外源基因定點(diǎn)整合到細(xì)胞基因組?;钚訲AT-ΦC31-NLS蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)4天后的細(xì)胞,蛋白免疫印記(Wes

9、ternblot)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)不能檢測到細(xì)胞中殘存的整合酶蛋白。細(xì)胞周期和早期細(xì)胞凋亡分析實(shí)驗(yàn)表明,TAT-ΦC31-NLS蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)對293和COS-1等哺乳動物細(xì)胞沒有明顯的影響。至此,我們應(yīng)用TAT-ΦC31-NLS蛋白優(yōu)化了ΦC31整合酶的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù),并且在哺乳動物細(xì)胞中有效介導(dǎo)外源hFIX基因定點(diǎn)整合在細(xì)胞基因組中,從而為更安全有效的轉(zhuǎn)移ΦC31整合酶進(jìn)入細(xì)胞的途徑提供了新的例證。TAT-ΦC31-NLS整合酶蛋白能夠從大量培養(yǎng)的

10、細(xì)菌中經(jīng)過一步快速的親和純化步驟制備,我們希望它能作為一個有效的工具應(yīng)用在哺乳動物細(xì)胞的基因操作和基因治療的領(lǐng)域。
   綜上所述,本文說明了鏈霉菌噬菌體ΦC31整合酶的在體外催化重組反應(yīng)的特性,為ΦC31整合酶在體外的基因重組操作和細(xì)胞中介導(dǎo)定點(diǎn)整合的應(yīng)用提供了基礎(chǔ);通過對ΦC31整合酶的修飾和轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)化,建立了在細(xì)胞中更有效和安全地利用ΦC31整合酶的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)方法,從而避免了利用的病毒和DNA載體可能造成的ΦC31整合酶

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