Fyn的RNA干擾和重要位點突變對神經(jīng)元遷移的影響及分子機制.pdf

1、哺乳動物大腦皮層六層結(jié)構(gòu)的形成依賴神經(jīng)元的正確遷移，該過程受到多種信號分子的調(diào)節(jié)，神經(jīng)元遷移障礙會造成多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Fyn是一種非受體酪氨酸激酶，F(xiàn)yn敲除小鼠大腦皮質(zhì)結(jié)構(gòu)異常，大腦皮質(zhì)淺層神經(jīng)元數(shù)量減少，晚出生神經(jīng)元異常定位在大腦皮質(zhì)深層。Fyn在神經(jīng)元遷移中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但其分子機制尚不清楚。為了研究Fyn對神經(jīng)元遷移的影響及其分子機制，我們結(jié)合本實驗室的前期研究結(jié)果，對Fyn在神經(jīng)元遷移中的作用及其調(diào)控進行進一步探索。<

2、br>　　為了研究Fyn對神經(jīng)元遷移的影響及其分子機制，利用子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染技術，并結(jié)合RNA干擾和基因定點突變探討了降低Fyn表達和N末端修飾位點突變對神經(jīng)元遷移和神經(jīng)元形態(tài)的影響。通過Western blot和免疫熒光染色檢測Fyn下游可能的信號分子，構(gòu)建這些分子的不同點突變載體，分別將其與Fyn超表達和干擾載體共同轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，探索Fyn調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移的信號通路。研究結(jié)果如下:
　　1.在之前的研究中我們已經(jīng)篩選出有效的干擾片段

3、，結(jié)合子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)降低Fyn表達不僅對晚出生的神經(jīng)元遷移有影響，還抑制早出生神經(jīng)元的遷移。在胚胎15.5天轉(zhuǎn)染標記晚出生的神經(jīng)元，出生后1天取材，對照組中大部分神經(jīng)元已經(jīng)到達它們的目的地——邊緣帶附近，干擾組中大部分被轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元則滯留在中間帶。并且，在出生后第7天，干擾組中許多神經(jīng)元仍停留在中間帶和皮質(zhì)板，說明干擾Fyn抑制神經(jīng)元遷移而不是延遲遷移。在胚胎12.5天轉(zhuǎn)染標記早出生神經(jīng)元，胚胎16.5天取材時對照組中神經(jīng)元遷移進入

4、皮質(zhì)板，干擾組大部分神經(jīng)元則滯留在中間帶。降低Fyn表達在遷移初期阻礙神經(jīng)元頂突起的形成，在中間帶和皮質(zhì)板交界處雙極神經(jīng)元比例降低，神經(jīng)元多數(shù)呈圓形且沒有形成明顯的頂突起;進入皮質(zhì)板的神經(jīng)元頂突起增長，但存在一些極性反轉(zhuǎn)的細胞;而接觸到邊緣帶的細胞則頂突起長度增加且分枝減少。
　　2.Fyn的N末端修飾包括第二位甘氨酸豆蔻?；揎棥⒌谌偷诹话腚装彼嶙貦磅；揎椧约暗谄吆偷诰盼患谆揎棧琋末端修飾對Fyn的功能具有重要調(diào)節(jié)作用

5、。利用基因定點突變構(gòu)建4種Fyn的N末端點突變真核表達載體:Fyn-G2A、Fyn-C3，6S、Fyn-K7A和Fyn-K7，9A。子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示在胚胎15.5天轉(zhuǎn)染后5天，F(xiàn)yn-WT超表達抑制神經(jīng)元遷移，神經(jīng)元在腦室區(qū)和中間帶形成團狀聚集，幾乎沒有到達邊緣帶附近的神經(jīng)元。各點突變載體轉(zhuǎn)染組中，大多數(shù)神經(jīng)元能夠接觸到邊緣帶，這與對照組相似但與Fyn-WT轉(zhuǎn)染組相比有顯著差異。Fyn-K7A，F(xiàn)yn-K7，9A轉(zhuǎn)染組中細胞聚集減

6、少，在Fyn-G2A，F(xiàn)yn-C3，6S轉(zhuǎn)染組中沒有神經(jīng)元聚集現(xiàn)象。Fyn-G2A轉(zhuǎn)染組中出現(xiàn)一些頂突起朝向腦室區(qū)的細胞，產(chǎn)生了類似干擾Fyn所引起的神經(jīng)元極性反轉(zhuǎn)。以上結(jié)果說明這些修飾位點在Fyn調(diào)節(jié)神經(jīng)元遷移的過程中有重要作用。
　　3.Western blot和免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Fyn引起FAK-Y925和PI3K-p85磷酸化，研究顯示Rho蛋白GTP酶對神經(jīng)元遷移有重要的調(diào)節(jié)作用。通過構(gòu)建FAK-Y925F（不可被磷酸化）

7、，RhoA-DN，RhoA-CA，Rac1-DN，Rac1-CA，結(jié)合子宮內(nèi)電擊轉(zhuǎn)染探索Fyn可能的信號通路。結(jié)果顯示在胚胎15.5天轉(zhuǎn)染后5天，F(xiàn)AK-Y925F+Fyn-WT轉(zhuǎn)染組多數(shù)神經(jīng)元到達邊緣帶附近，細胞聚集明顯減少，說明FAK-Y925F能夠挽救Fyn-WT造成的神經(jīng)元遷移障礙和細胞異常聚集。Fyn-WT+Rac1-DN和shFyn+Rac1-CA轉(zhuǎn)染組神經(jīng)元在各層的分布與對照組和Fyn-WT組相比均有顯著差異，神經(jīng)元聚集減

8、少，但仍有大量細胞形成團狀或柱狀聚集，說明Rac1參與Fyn對神經(jīng)元遷移的調(diào)節(jié)，但只能在一定程度上挽救Fyn所引起神經(jīng)元遷移障礙。Fyn-WT+RhoA-DN和shFyn+RhoA-CA轉(zhuǎn)染組神經(jīng)元在不同層的分布與對照組相似，F(xiàn)yn-WT+RhoA-DN轉(zhuǎn)染組形成聚集的神經(jīng)元明顯減少，shFyn+RhoA-CA轉(zhuǎn)染組大部分神經(jīng)元在中間帶和皮質(zhì)板交界處可以形成典型的雙極形態(tài)，且皮質(zhì)板中部分神經(jīng)元頂突起恢復正常，但是到達邊緣帶的神經(jīng)元仍然有