利用細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度變化檢測(cè)乙酰膽堿.pdf

1、本論文共包括三部分內(nèi)容： 前言部分首先對(duì)激光共聚焦熒光顯微鏡和落射熒光顯微鏡及其工作原理進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹；然后介紹了細(xì)胞內(nèi)的第二信使一鈣離子以及與之相關(guān)的鈣離子通道，著重介紹了受體門控的鈣通道、膽堿能受體及其效應(yīng)機(jī)制；最后對(duì)乙酰膽堿及其檢測(cè)方法進(jìn)行了總結(jié)和評(píng)述。 第一章采用激光誘導(dǎo)熒光的方法檢測(cè)鈣離子，選擇Fluo-3AM為鈣離子熒光探針，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度變化檢測(cè)乙酰膽堿的含量。首先，鈣離子熒光探針在室溫下30 m

2、in負(fù)載，在細(xì)胞內(nèi)酯酶的作用下脫掉乙酰甲酯變成Fluo-3，F(xiàn)luo-3與細(xì)胞內(nèi)游離的Ca<'2+>結(jié)合。用激光共聚焦顯微鏡連續(xù)掃描細(xì)胞，獲得加乙酰膽堿前后的熒光圖像。對(duì)圖像的分析結(jié)果說(shuō)明乙酰膽堿能引起細(xì)胞內(nèi)的鈣離子的濃度升高。用落射熒光顯微鏡確定檢測(cè)乙酰膽堿的最佳條件，用EMCCD獲得熒光圖像，數(shù)據(jù)結(jié)果由MateMorph軟件測(cè)量分析。濃度為5.0X10<'-13>～1.0X10<'-11>mol/L時(shí)，乙酰膽堿與熒光信號(hào)的增加值有較

3、好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為3.2×10<'-13>mol/L。 第二章采用微流控分析芯片與單細(xì)胞分析相結(jié)合的方法檢測(cè)了乙酰膽堿的含量。通過(guò)模塑法制作了通道直徑為約100μm PDMS微流控芯片，利用微流控芯片單細(xì)胞進(jìn)樣。選擇Fluo-3 AM為鈣離子熒光探針，乙酰膽堿刺激單個(gè)細(xì)胞。用落射熒光顯微鏡檢測(cè)了單個(gè)細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>的熒光強(qiáng)度變化。當(dāng)乙酰膽堿濃度為1.0x10<'-13>～3.0X10<'-11>mol/L時(shí)，檢測(cè)到的熒光