尼古丁增加大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的作用與機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）以肺血管壁增厚、血管重構(gòu)以及肺動(dòng)脈壓持續(xù)性、漸進(jìn)性增高為主要臨床病理特征，最終導(dǎo)致右心室肥厚、右心衰竭，引起患者死亡為特征的一組惡性肺血管疾病。其中，慢性肺病相關(guān)肺動(dòng)脈高壓是慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的重要合并癥，是影響 COPD患者病程的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)吸煙是導(dǎo)致CO

2、PD和相關(guān)PH的主要原因之一。以往的研究認(rèn)為COPD合并肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制主要是由于缺氧導(dǎo)致肺血管收縮和肺血管重構(gòu)。新近的人類和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)資料顯示香煙煙霧有效成分可直接作用于肺血管系統(tǒng)，最終導(dǎo)致異常血管重構(gòu)和血管收縮反應(yīng)。然而，香煙煙霧導(dǎo)致PH的具體機(jī)制尚不清楚。肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs）內(nèi)的鈣濃度失衡，是肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而經(jīng)典瞬時(shí)受體蛋白（T

3、ransient Receptor Potential Canonical Channels,TRPC）組成的鈣池操縱性鈣通道（store-operated calcium channel，SOCC）是細(xì)胞內(nèi)鈣濃度（intracellular calcium concentration，[Ca2+]i）失衡的重要因素。香煙煙霧可以上調(diào)PASMCs中TRPC蛋白的表達(dá)，增加[Ca2+]i。尼古丁為香煙煙霧的主要有害成分，尼古丁是否通過作用

4、于肺動(dòng)脈平滑肌上煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）從而影響肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上TRPC蛋白的表達(dá)而參與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)，值得深入探討。
　　研究目的：
　　本研究應(yīng)用大鼠遠(yuǎn)端 PASMCs原代培養(yǎng)模型觀察尼古丁刺激對細(xì)胞基礎(chǔ)鈣和鈣池操縱性鈣內(nèi)流（store-operated calcium entry，SOCE）的影響；觀察尼古丁刺激對PASMCs中TRPC1、

5、TRPC6蛋白表達(dá)的影響；應(yīng)用特異性小分子干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）沉默TRPC1、TRPC6表達(dá)，觀察尼古丁是否通過TRPC蛋白調(diào)節(jié)PASMCs中[Ca2+]i；研究PASMCs上煙堿型乙酰膽堿受體亞基的表達(dá)情況，觀察尼古丁刺激對PASMCs上nAChRα7亞基表達(dá)的影響。從而探討尼古丁刺激參與PASMCs中鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的機(jī)制，為防治呼吸疾病相關(guān)的肺動(dòng)脈高壓尋找有效靶點(diǎn)。
　　研究方法：<

6、br>　　建立原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞模型：（1）利用InCyte細(xì)胞內(nèi)鈣濃度檢測系統(tǒng)，檢測尼古丁刺激對大鼠PASMCs的基礎(chǔ)[Ca2+]i和SOCE的影響；（2）應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative，PCR）法檢測尼古丁對大鼠遠(yuǎn)端PASMCs TRPC1、TRPC6和nAChRα7的mRNA表達(dá)的影響。（3）應(yīng)用Western blotting檢測尼古丁對大鼠遠(yuǎn)端PASMCs TRPC1、TRPC6

7、蛋白表達(dá)的影響。（4）應(yīng)用特異性的siTRPC1、siTRPC6預(yù)處理后檢測尼古丁刺激對大鼠PASMCs的基礎(chǔ)[Ca2+]i和SOCE的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1、尼古丁（10nM,24h）刺激可以增加大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞基礎(chǔ)鈣和SOCE。
　　2、尼古?。?0nM,24h）刺激可以上調(diào)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TRPC1、TRPC6 mRNA和蛋白水平。
　　3、特異性的siTRPC1和siTRPC6可以抑制尼古

8、丁引起的TRPC1、TRPC6蛋白表達(dá)的上調(diào)，抑制尼古丁引起的基礎(chǔ)鈣和SOCE的上調(diào)。說明 TRPC1、TRPC6介導(dǎo)了尼古丁對肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。
　　4、大鼠PASMCs表達(dá)的nAChR的亞基有：α3,α5,α7,β2,β3和β4。
　　5、尼古丁刺激可以上調(diào)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上nAChRα7亞基mRNA的表達(dá)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　大鼠PASMCs表達(dá)nAChR，尼古丁可能通過上調(diào)相關(guān)的n