載體構(gòu)建

1、載體構(gòu)建分為以下步驟：1.載體的選擇和引物設(shè)計(jì)以擴(kuò)增目標(biāo)基因2.目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增3.載體和目標(biāo)片段的限制性酶切4.連接轉(zhuǎn)化5.挑取克隆提質(zhì)粒6.單克隆的驗(yàn)證及送樣測序。載體的選擇載體的選擇實(shí)驗(yàn)室常用的載體有pUC19（擴(kuò)繁目標(biāo)片段），pet28a（原核表達(dá)載體Kna），pGEX4T1(原核表達(dá)載體Amp)，pCINEO(真核表達(dá)載體Amp)，pCDNA3.1(真核表達(dá)載體Amp)，pLKO.1(shRNA構(gòu)建Amp)。根據(jù)所要構(gòu)建的

2、質(zhì)粒目的的差異以及載體和目標(biāo)片段的酶切位點(diǎn)分析結(jié)果來選擇載體。舉例如下：實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖菍YC基因插入到載體中，轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中表達(dá)。應(yīng)選用真核表達(dá)載體pCINEO或pCDNA3.1。引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)的目的是將目標(biāo)片段擴(kuò)增出來以便與載體連接，所以在引物的兩端應(yīng)人為加上酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)前加上保護(hù)堿基。在選擇酶切位點(diǎn)是應(yīng)注意，選擇的應(yīng)該是目的基因片段中沒有而載體上有的限制性內(nèi)切酶，防止目標(biāo)片段被切不完整，也便于和載體連接。載體構(gòu)建之后我們

3、的目的是要表達(dá)，所以應(yīng)該加入標(biāo)簽以便westernblot檢測蛋白是否表達(dá)。常用的標(biāo)簽有Flag標(biāo)簽、6XHis標(biāo)簽、HA標(biāo)簽和Myc標(biāo)簽。Flag標(biāo)簽：DYKDDDDKGATTACAAGGATGACGACGATAAG6XHis標(biāo)簽：HHHHHHCACCACCACCACCACCACHA標(biāo)簽：YPYDVPDYATACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTMyc標(biāo)簽：EQKLISEEDL這些標(biāo)簽被表達(dá)成氨基酸后，特定的氨基酸序列會(huì)