細胞因子生物學活性檢測

1、細胞因子生物學活性檢測細胞因子水平測定是細胞免疫功能檢測的一個重要組成部分。由于許多細胞因子cDNA克隆和表達的成功，給細胞因子單克隆抗體制備、生物學功能的鑒定提供必要條件。目前檢測細胞因子水平主要包括兩類方法：一是生物學活性的檢測，這類方法是利用細胞因子某一特定的生物學作用所設計的檢測方法，如IL2維持活化T細胞的增殖，IFN能保護病毒對正常細胞的感染，TNFα選擇性殺某些腫瘤細胞等，因此敏感性也較高；二是定量的檢測，常用酶聯(lián)免疫吸附

2、試驗(ELISA)，如多克隆抗體與單克隆抗體，識別不同表位兩種單克隆抗體的雙抗體夾心法，生物學和定量的檢測方法各有優(yōu)缺點，在必要時可同時進行檢測。一、白細胞介素1(IK1)生物學活性測定白細胞介素1是一種重要的細胞因子，主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，IL1不僅對多種免疫活性細胞有重要的調節(jié)功能，而且與發(fā)熱、炎癥發(fā)生以及某些疾病的病理變化有關。目前對IL1產(chǎn)生水平的檢測主要應用生物學活性檢測的方法。ConA刺激小鼠胸腺細胞檢測IL1生物學活性(

3、一)原理小鼠胸腺細胞在絲裂原刺激下表達IL1受體，在有IL1同時存在的條件下，IL1可協(xié)同絲裂原促T細胞的增殖作用。根據(jù)加入IL1后增殖水平(３HTdR摻入率)的增加可計算出樣品中IL1的活性單位，或計算出刺激指數(shù)。(二)操作步驟取6～8周齡C57BL16小鼠，拉頸處死，無菌取胸腺置不銹鋼網(wǎng)篩上，用注射器針蕊研磨成細胞懸液調整細胞數(shù)為1.510７／ml↓細胞懸液內加入ConA，使終濃度為3μg／ml，在96孔培養(yǎng)板中加100μl(1.5

4、10６細胞)↓加入不同稀釋度待測樣品和IL1標準品100μl／孔(ConA終濃度為1.5μg／ml)↓37℃CO２孵箱66h每孔加３HTdR0.5μci↓37℃CO孵箱6h多頭細胞收集儀收獲于9999型玻璃纖維紙上↓烤干，移入液閃瓶中，加適量閃爍液，于液閃儀上測β計數(shù)計算:1.從IL1標準曲線上測得IL1的活性單位2.也可用刺激指數(shù)(SI)表示加入96孔板中，兩種細胞各加50μl孔↓加入不同稀釋度的IL1或待測樣品，同時設EL４和CT

5、LL2細胞對照↓置5％CO２37℃培養(yǎng)24～28小時后加入３HTdR0.5μci50μl孔繼續(xù)培養(yǎng)6～8小時↓收集樣品，β計數(shù)㈢試劑和器材1.EL４細胞2.CTLL2細胞3.標準rIL1。4.３HTdR、POPOP、PPO、二甲苯。5.玻璃纖維濾紙，細胞收集儀。6.β計數(shù)儀7.96孔板，無菌吸管，滴管、試管及加樣器頭。8.FCSRPMI1640CO２培養(yǎng)箱等。㈣注意事項：1.在一步法檢測IL1時，其EL４細胞濃度不宜超過110４孔，血清

6、終濃度應＜5％。2.在二步法檢測IL1時，其EL４細胞濃度在210５孔時，犉d轉移上清稀釋度不宜低于1∶8其誘導時間應12～24小時間為佳。誘導血清濃度應≤1％。3.在檢測經(jīng)誘導的上清中IL1時，應避免使用A23187，TPA和ConA等較強的能誘導EL４細胞產(chǎn)生IL2的誘導劑來刺激IL1的產(chǎn)生。二、白細胞介素2(IL2)的生物學活性測定(一)原理IL2主要由活化T細胞產(chǎn)生，又為T細胞增殖所必需，故稱T細胞生長因子（TCellGrowt

7、hfactTCGF）。IL2產(chǎn)生的水平反映T細胞的功能，牪僅是免疫調節(jié)重要的研究對象，而且與臨床多種疾病密切相關，CTLL是C57BL／6來源的。犘!鼠殺傷性T淋巴細胞細胞系，由Gills1977年建立，只有在IL2存在的培養(yǎng)基中才能生長。因此可作為指示細胞來測定待檢樣品中IL2的水平。除CTLL外，絲裂原活化的T淋巴母細胞亦可作為檢測IL2活性的指示細胞。(二)方法可根據(jù)實驗室條件，選用３HTdR摻入法和MTT法1.３HTdR摻入法I