免疫磁珠技術

1、免疫磁珠技術（IMB）在食品有害微生物檢測中的應用,資料搜集：武菁菁、張端莉、譚玉榮、周夢柔PPT制作：孫文靜、魏煒報告人 ：孫文靜,目錄,1 免疫磁珠技術簡介1.1 免疫磁珠的結構與性質(zhì)1.2 免疫磁珠技術2 免疫磁珠技術的應用2.1 IMB技術在食品有害微生物檢測中的應用2.2 免疫磁珠與其它檢測手段的聯(lián)用2.3 免疫磁珠技術在其他領域的應用2.4 免疫磁珠技術的優(yōu)缺點及發(fā)展方向,1.免疫磁珠技術簡介

2、,1.1 免疫磁珠的結構與性質(zhì)1.1.1 免疫磁珠的結構 免疫磁珠（IMB）， 也稱免疫磁性微球， 是一種均勻、具有超順磁性及保護性殼的球形小粒子，基本上由載體微球和免疫配基結合而成。其核心為順磁性粒子，核心外層包裹一層高分子料， 最外層是免疫配基。,載體微球,金屬小顆粒（Fe2O3、Fe3O4）,如聚乙烯亞胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯脂、聚丙烯酸、酶類、多糖（淀粉、纖維素、葡聚糖、果膠等）、球蛋白和牛血清白蛋白等，,如

3、氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羥基(-OH)，使其表現(xiàn)具有疏水-親水、非極性-極性、帶正電荷-帶負電荷等不同的物理性質(zhì)。,免疫配基,免疫配基通過生物高分子的功能基團結合到磁性載體微球上形成免疫磁珠。由于載體微球制備材料和方法不同，其表現(xiàn)出的物理性質(zhì)也不同， 從而可結合不同的免疫配基， 如抗原、抗體、凝集素、DNA 和RNA 等。配基必須具有生物專一性的特點， 而且載體微球與配基結合要不影響或改變配基原有的生物學特性， 保證磁珠的

4、特殊識別功能。,1.1.2 免疫磁珠的性質(zhì),由于免疫磁珠的大小和形狀具有均一性， 從而可使靶物質(zhì)迅速和有效地結合到磁珠上，也可使生成的新復合物在磁場中具有相同的磁響應性，且行為一致磁珠的球形結構可消除與不規(guī)則形狀粒子有關的非特異性結合順磁性可使磁珠置于磁場時顯示其磁性，并做定向移動， 從磁場移出時磁性消除， 磁珠分散， 由此可方便地進行分離和磁性導向保護性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕； 免疫配基可特異性地結合反應體系中相應

5、的抗原、抗體、核酸等生物活性物質(zhì)。,1.2 免疫磁珠技術,免疫磁珠( immunomagnetic bead, IMB)技術：是一種以特異的抗原抗體反應為基礎的免疫學檢測和分離技術。它是以抗體包被的磁珠為載體，通過抗體與反應介質(zhì)中特異性抗原結合，形成抗原—抗體復合物，此復合物在外加磁場的作用下發(fā)生定向移動，從而達到分離抗原的目的?；驹恚捍判晕⑶蚪?jīng)過一定處理后,可將抗體結合到磁珠上,形成免疫磁性微球,免疫磁性微球的抗體與特異性抗

6、原結合形成抗原—微球復合物,該復合物在磁場中具有與其它組分不同的磁響應性,在磁力作用下,該復合物發(fā)生力學移動,從而達到分離抗原的目的。,以細胞分離為例圖解免疫磁珠技術的原理,2.1 食品有害微生物檢測中的應用,免疫磁珠技術與常規(guī)檢驗方法相比具有顯著的優(yōu)點，它能從樣品中迅速、有選擇性地分離出目的微生物，有效地減少了背景的干擾，提高了精準性。還能捕獲受損傷的靶細菌，而目前所用的幾種常規(guī)方法則不具備這樣的能力。目前，免疫磁珠技術已經(jīng)廣泛應用

7、于食品樣品中致病微生物的檢測。,2 .免疫磁珠技術的應用,2.1.1 大腸桿菌O157的檢測,,傳統(tǒng)分離E.coli O157∶H7所采用的直接分離法存在著鑒別力差、抑制雜菌能力弱、耗時長、工作量大等缺點。采用免疫磁珠技術，能夠快速地從各種食品樣品中分離富集E.coli O157∶H7，滿足流行病學的研究要求和提高控制力度。 現(xiàn)在這種免疫磁珠的方法已經(jīng)被英國公共健康服務實驗室認定為標準的分離方法，我國也已將免疫磁珠法對大腸桿

8、菌O157的檢測納入國家標準（GB/T 4789.36-2008）和出入境檢驗檢疫行業(yè)標準(SN/T 1059.5-2006)。,檢樣25g(mL)+225mL改良EC肉湯（mEC+n），均質(zhì)225mL,免疫磁珠捕獲,涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157弧菌顯色瓊脂平板,挑取可疑菌落5個~10個，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌接種TSI,MUG-LST,陽性,GB/T 4789.36-2008 免疫磁珠捕獲法檢測程序,

9、陰性,血清學試驗,非O157細菌,生化試驗,報告,↓,↓,↓,↓,↓,↓,↓,↓,36± 1oC,18h~24h,36± 1oC,36± 1oC,18h~24h,18h~24h,增菌    免疫磁珠捕獲與分離 1.將Eppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進行編號，每個樣品使用1支Eppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕振蕩E. coli

10、 O157免疫磁珠溶液后，用開蓋器打開每支Eppendorff管的蓋子，每管加人20 μL E. coli 0157免疫磁珠懸液。 2.取mEC+n肉湯增菌培養(yǎng)物1 mL，加人到Eppendorff管中，蓋上蓋子，然后輕微振蕩10 s。每個樣品更換1支加樣吸頭，質(zhì)控菌株必須與樣品分開進行，避免交叉污染。,具體操作步驟,3.結合:在18℃~30℃環(huán)境中，將上述Eppendorff管連同磁板架放在Dynal MXl樣品混合器上轉(zhuǎn)動或

11、用手輕微轉(zhuǎn)10 min，使E. coli O157與免疫磁珠充分接觸。 4.捕獲:將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。在3 min內(nèi)不斷地傾斜磁板架，確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來，此時，在Eppendorff管壁中間明顯可見圓形或橢圓形棕色聚集物。 5.吸取上清液:取1支無菌加長吸管，從免疫磁珠聚集物對側深人液面，輕輕吸走上清液。當吸到液面通過免疫磁珠聚集物時，應放慢速度，以確保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含

12、有磁珠，則應將其放回到Eppendorff管中，并重復4步驟。每個樣品換用1支無菌加長吸管。,6.洗滌:洗滌免疫磁珠混合物。重復上述步驟 4~ 6 。 7.重復上述步驟4 ~ 5 。 8.免疫磁珠懸浮:將免疫磁珠重新懸浮在100 μL PBS-Tween 20洗液中。 9.涂布平板:用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取50 μL免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMAC平板和改良CHROMagar O15

13、7弧菌顯色瓊脂平板一側，然后用無菌涂布棒將免疫磁珠涂布平板的一半，再用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于36℃士1 0℃培養(yǎng)18 h---24 h 。,菌落識別 在CT-SMAC平板上，典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色;發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色;在改CHROMagar O157弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫色一紫紅色，邊緣無色

14、或淺灰色。初步生化試驗: 在CT-SMAC和改良CHROMagar O157弧菌顯色瓊脂平板上挑取5個~10個典型或可疑菌落，分別接種TSI瓊脂，同時接種MUG-LST肉湯，于36℃士1℃培養(yǎng)18 h~24 h。必要時進行氧化酶試驗和革蘭氏染色。在TSI瓊脂中，典型菌株為斜面與底層均呈陽性反應呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫(H2S)。置MUG-LST肉湯管于長波紫外燈下觀察，無熒光產(chǎn)生

15、者為陽性結果，有熒光產(chǎn)生者為陰性結果;對分解乳糖且無熒光的菌株，在營養(yǎng)瓊脂平板上分純，于36℃士1℃培養(yǎng)18 h~24 h，并進行鑒定。,大腸桿菌o157的檢測,,Fratamico等將兔抗E.coli O157∶H7多克隆抗體連接到羊抗兔IgG包被的磁珠上，從食物增菌培養(yǎng)液中分離O157∶H7菌株，再將帶菌的磁珠接種到培養(yǎng)基上，加入熒光素標記的O157∶H7抗血清，在熒光顯微鏡下觀察，此法敏感性為10cfu/mL增

16、菌培養(yǎng)液。Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂質(zhì)體（IMB/IL）熒光試驗方法，可在8h內(nèi)快速檢測出多種液態(tài)樣品（水樣、蘋果汁、蘋果酒）中低至1cfu/mL的E. coli O157∶H7，而傳統(tǒng)微生物學方法不能從陰性樣本中區(qū)分出E. coli O157∶H7感染樣本。,2.1.2 單核細胞增生李斯特菌的檢測,,傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測方法檢測周期長，約5～14d，步驟繁瑣且靈敏度低，而IMB技術的優(yōu)點在于在較低的菌液濃度時也可以通過免

17、疫磁珠的富集作用進行檢測，縮短了檢測時間并進一步降低了單增李斯特菌的檢測限。,2008年，我國將免疫磁珠檢測單核細胞增生李斯特菌的方法納入了出入境檢驗檢疫行業(yè)標準中(SN/T 0184.3-2008)。,檢樣25g(mL),對225mLFB1増菌液（30 ℃士1℃ ，24h士1h）,1mL轉(zhuǎn)種10mL FB2増菌液（ 35℃ ，24h士1h）,通過免疫磁珠捕獲李斯特菌，然后再用滅菌緩沖液洗滌,用0.1mL的滅菌緩沖液重新制成懸液,吸取5

18、0uL免疫磁珠懸液劃線于CHROMagar 顯色培養(yǎng)基，OXA/PALCAM瓊脂平板（35 ℃ +1 ℃,24h~28h),各挑選5個典型菌落,接種于TSA-YE瓊脂平板，純培養(yǎng),鑒定和確認試驗,單增李斯特菌的檢測方法,1樣品制備 2增菌 3免疫磁珠分離((IMS） 1)免疫捕獲    混增菌培養(yǎng)液.沉淀所有的粗糙食物殘渣.從增菌培養(yǎng)液中移取1mL上層液體(要盡可能避免移取到

19、食物顆粒和脂肪顆粒)加人Eppendorf管中.加20μL準備好的免疫磁珠。在旋渦混合器上混合該懸液。,2）分離    將Eppendorf管固定在磁架的管孔中。1800輕緩擺動磁架5次--6次,使免疫磁珠聚集到磁極。小心地打開磁架上的Eppendorf管管蓋,從磁極對面一側慢慢吸出液體，注意不要接觸管壁上的磁珠。每一個樣品換一次槍頭;加1 mI滅菌的PBS ，并重新蓋好蓋子

20、.將磁極從支架上移走，1800輕緩擺動磁架5次一6次,使管內(nèi)各成分混合,后重新將磁極放回到支架上。重復該清洗步驟幾次。將離心管從磁性分離器上移開.并加100μL滅菌的PBS到管中，重懸磁珠。如果實驗室沒有磁性分離器.，可以用手搖代替. 4.分離培養(yǎng) 1）分離培養(yǎng),吸取50μL免疫磁珠懸液.加到顯色培養(yǎng)基及任一選擇性培養(yǎng)基OXA、PALCAM瓊脂平板上.用無菌接種環(huán)劃線.35℃士1℃培養(yǎng)22h-48h。 2）篩選

21、    李斯特氏菌在CHROMagar顯色培養(yǎng)基上菌落為藍色.且在其周圍形成一個暈環(huán)。李斯特氏菌在OXA瓊脂平板上生長22 h后菌落呈現(xiàn)黑色.直徑為1mm.在其周圍形成一個黑色環(huán)。培養(yǎng)48h，菌落仍呈黑色.直徑2mm --3mm.除在菌落周圍有一環(huán)外.在菌落中心部位的深層也形成黑點。李斯特氏菌在PALCAM瓊脂平板上與在()XA瓊脂平板上菌落相似。在CHROMagar顯色培養(yǎng)基

22、及OXA或PALCAM瓊脂平板上挑取5個或更多可疑菌落.接種于TSA-YE瓊脂平板上.純培養(yǎng)后進鑒定。 5.鑒定和確認,單核細胞增生李斯特氏菌的檢測,,Skjerve等通過包被單克隆抗體的磁珠從不同食物樣品中分離李斯特菌，采用將磁珠接種到瓊脂平板培養(yǎng)的方法進行菌株鑒定，此法的敏感性為102～104cfu/mL樣品。Hudson等研究表明，將免疫磁珠技術與PCR結合，24h內(nèi)即可檢出火腿中的單增李斯特菌。,2.1.3 沙門氏

23、菌的檢測,例1：Notzon等用IMB-熒光PCR檢測肉類中的沙門氏菌，實驗包括非選擇性增菌、免疫磁珠分離、DNA提取及PCR擴增，12～13h即可完成檢測過程，IMB-熒光PCR在檢測自然感染肉類和人工感染肉類都具有較高的敏感性和特異性。,例2：Blackburn 等將用生物素標記的抗沙門菌多價多克隆抗體連接到鏈霉親和素包被的磁珠上，以此試劑檢測從不同食物中提取的活沙門菌。此法的敏感性可達105cfu/g 食物，總的檢測時間從5d減少

24、至1~2d。,IMB技術的優(yōu)點,IMB技術適用于各類食品基質(zhì)中的沙門氏菌的快速檢測，能快速有效富集食品基質(zhì)中的目標病原菌，且有良好的靈敏度和特異性，檢測限可達到1—10cfu/25g;在檢測時間方面可將常規(guī)檢測方法中的72小時檢測周期縮短至40小時，而且能有效減輕過程交叉污染;篩選結果既可以與常規(guī)的細菌生化和血清學聯(lián)用，也可以和顯色培養(yǎng)基、熒光PCR以及微生物全自動鑒定儀器等方法聯(lián)用，為食源性致病菌的檢測和鑒定提供了有效的快速篩選技術。

25、,2.1.4 金黃色葡萄球菌的檢測,例1：陳伶俐等將人IgG結合到磁珠上，用該磁珠對樣品中的金黃葡萄球菌進行了快速分離檢驗。取適量免疫磁珠，加入金黃葡萄球菌菌液中，磁場下分離磁珠，將分離前后的菌液及磁珠涂平板，并用大腸桿菌、白葡萄球菌等作對照。結果用此磁珠分離后，只有金黃葡萄球菌的濃度有明顯的降低。對磁珠所涂平板的菌落進行鑒定，證明為金黃葡萄球菌。應用此法分離檢驗此菌，富集速度快，靈敏度高，效果好。,例2：劉琳琳利用自制的金屬螯合免疫磁

26、珠來檢測食品中金黃色葡萄球菌，該法能夠在30min內(nèi)富集檢測金黃色葡萄球菌且檢測低限可達100 CFU，同時磁珠可保持活性達3周以上。,2.1.5 副溶血性弧菌的檢測,Hara-Kudo等利用IMS和顯色培養(yǎng)基分離貝類中產(chǎn)TDH的副溶血性弧菌O3:K6。Datta等利用副溶血性弧菌ATCC17802制備針對極鞭毛的單克隆抗體,這將有益于快速檢測從環(huán)境來源的副溶血性弧菌。張凡非等利用IMS分離環(huán)境及食品中產(chǎn)生TDH副溶血性弧菌，分別從1份

27、,海水、1份海泥和3份蛤肉中檢出了神奈川現(xiàn)象陽性,并產(chǎn)生耐熱溶血毒素的副溶血性弧菌,血清型為03:K6。,IMB技術優(yōu)點,該方法與一般的細菌培養(yǎng)分離法相比,極大地提高了環(huán)境樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率。利用IMS可有效地吸附、濃縮大量樣品中的少量病原微生物, IMS為難于從環(huán)境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問題提供一種有效手段。,2.1.6 其他致病菌的檢測,志賀氏菌例：Islam等應用O抗原特異性單克隆抗體包被免疫磁珠

28、，快速檢測糞便中的疾痢志賀菌和福氏志賀菌。分離出的志賀菌株用PCR擴增方法進行鑒定。此種免疫磁珠分離與PCR聯(lián)合法檢測志賀菌，較傳統(tǒng)的培養(yǎng)法敏感、快速(7 h)。,小腸結腸炎耶爾森氏菌例：Kapperud等用抗小腸結腸炎耶爾森氏菌血清抗體包被磁性微球，從食物和水樣中分離，并能將小腸結腸炎耶爾森氏菌與假結核耶爾森氏菌和非致病性耶爾森氏菌區(qū)別開來。,2.2免疫磁珠與其它檢測手段的聯(lián)用,2.2.1 免疫磁珠與PCR的聯(lián)用 鑒于PC

29、R 技術靈敏度較低這一缺點，將免疫磁珠技術和PCR 技術相結合，建立了新的檢測系統(tǒng)—— 磁免疫PCR。例如：它以李斯特氏菌單抗包被磁珠，對樣品進行前處理，將菌進行富集裂解，再以iap 基因的保守區(qū)域設計引物進行PCR結果顯示該方法具有良好的特異性，而且十分靈敏。,2.2.2 免疫磁珠與ELISA的聯(lián)用 利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白IgG抗體致敏，制備特異性捕獲甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素標記抗體為示蹤抗體，結合

30、辣根過氧化物酶標親和素建立ELISA檢測系統(tǒng)，用于甘草藥材和含甘草中成藥中甘草蛋白的分析。結果 用該方法對甘草藥材和中成藥中甘草蛋白抗原檢測，檢測靈敏度10ng／mL。免疫磁性捕獲ELISA檢測技術方便、快速、準確，為生藥的品種鑒定及中成藥的質(zhì)量控制提供一種新方法。,2.2.3 免疫磁珠與發(fā)光檢測手段的聯(lián)用 發(fā)光手段分析包括熒光免疫分析、電化學發(fā)光分析等。,免疫磁珠熒光微球,2.3 IMB技術在其他領域中的應用,2.3.1免疫檢測

31、 IMB技術不僅應用于食品中有害微生物的檢測，它在醫(yī)學領域也有廣闊的應用前景，它可以檢測腫瘤細胞，如骨髓中腫瘤細胞的檢測和淋巴結中腫瘤細胞的檢測。另外這種技術還可以對腫瘤進行磁導向治療和免疫磁性凈化治療。,2.3.2 細胞分離,細胞分離是免疫磁珠目前應用最主要的一個方面，傳統(tǒng)細胞分離技術有的比較費時，有的十分昂貴，由于免疫磁珠技術分離細胞時只需要抗體和磁鐵，既簡便靈敏又經(jīng)濟快捷。分離細胞有兩種方式，用免疫磁珠直接從細胞混合液中

32、分離靶細胞的方法稱為陽性分離，用免疫磁珠去除無關細胞使靶細胞得以純化的方法稱為陰性分離。馬東初用GPⅡb/Ш a血小板單克隆抗體結合磁珠分離人骨中的巨核細胞，其純度達到87.5%到97.1%，且50%的巨核細胞具有生物活性，且磁珠分離的巨核細胞超微結構保持完整，可用于巨核細胞的細胞生物學和分子生物學等方面的研究。,2.3.3 生物大分子純化,免疫磁珠可以看作是親和層析技術中的微型配基，體，在基質(zhì)上固相化抗體或抗原后，形成特異性吸附后，

33、再進行磁性親和抽屜不需離心過濾，用于分離和純化相應的生物大分子。為提純受體分子、DNA、RNA、DNA結合蛋白及mRNA等提供希望。,2.3.4 分子生物學的應用,免疫磁珠可借助親和素——生物素系統(tǒng)與非蛋白結合（如各種DNA、RNA大分子）。先將PCR雙鏈產(chǎn)物與生物素化的磁珠混合使兩者結合，然后進行堿性變性處理，使PCR雙股DNA成為單股DNA，可直接快速用于檢測PCR樣品中DNA或RNA分子并可進行測序。,2.4 IMB技術優(yōu)缺點及發(fā)

34、展方向,優(yōu)點:分離速度快、效率高、可重復性好、操作簡單，不需要昂貴的儀器設備,不影響被分離細胞或其它生物材料的生物學性狀和功能等,從而在微生物檢測方面具有很大的優(yōu)勢。　但在IMB應用過程中,目前仍然存在著一些問題: 　1、進口的免疫磁珠價格昂貴,而國產(chǎn)的磁珠在敏感性等方面還需要進一步的實驗改進?！?、免疫磁珠分離方法的特異性與所用的抗體密切相關,有可能不能避免與其他雜菌交叉反應,因此也需要輔助其他方法同時進行檢測,如選擇性分離平板