基因診斷與基因治療

1、基 因 診 斷 與基 因 治 療,基因診斷的概念,基因是遺傳學上的一個概念，是在染色體上占有一定的位置，表現(xiàn)一定功能的基本單位基因的物質(zhì)基礎是脫氧核糖核酸（DNA）（有些病毒的基因是核糖核酸，RNA）基因診斷是指運用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學方法檢查基因的結(jié)構及其表達產(chǎn)物，是目前診斷技術中最具發(fā)展前途的技術。,基因診斷的分子生物學基礎,基因診斷操作的對象為基因或其片段運用現(xiàn)代分子生物學和分子遺傳學方法，檢查特定基因的存在與否、基

2、因的結(jié)構及其表達功能是否正常等，從而確定：是否患有某種遺傳?。撼赡耆诉z傳型分析，產(chǎn)前診斷是否患有某些特定的微生物感染疾病是否患有某種腫瘤，對腫瘤病人的預后進行分析基因配型，用于移植、輸血等法醫(yī)學上，分析犯罪現(xiàn)場的證實與嫌犯的鑒別,基因診斷的途徑,檢查是否存在特定的DNA或RNA，用于微生物感染的診斷基因突變的檢測限制性內(nèi)切酶酶譜分析等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法基因連鎖分析限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)基因

3、的單堿基多態(tài)性分析(SNP)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA檢測基因型的鑒定與比較,基因診斷的對象,1、病原生物的侵入：一般侵入體內(nèi)的病原生物可通過顯微鏡檢查各免疫學方法進行診斷。直接檢測病原生物的遺傳物質(zhì)提高診斷的敏感性2、先天遺傳性疾患：已有多種傳統(tǒng)的遺傳性疾患的發(fā)病原因被確定為特定基因的突變。例如：苯丙氨酸羥化酶基因突變可引起苯丙酮尿癥：腺苷脫胺酶基因突變可引起重癥聯(lián)合免疫缺陷癥（SCID)；而淋巴細胞表面分子CD40或其配體（CD40

4、L）基因突變則可引起無丙種球蛋白血癥。用基因診斷的方法檢測其基因突變利于確診和治療方案的建立3、后天基因突變引起的疾?。耗[瘤。腫瘤的發(fā)生是由于個別細胞基因突變而引起的細胞無限增殖?；蛟\斷可確定抑癌基因發(fā)生突變還是癌基因發(fā)生突變4、其它：如DNA指紋、個體識別，親子關系識別，法醫(yī)物證等,基因診斷的運用,一是通過檢測特定基因或相關疾病基因的存在以判斷和評估某疾病在某一個體上發(fā)生某疾病的風險，以導向預防這種疾病的發(fā)生二是通過基因診斷促

5、使個性化藥物的誕生三是通過基因診斷更精確判斷某些傳染性疾病或腫瘤等疾病的存在，以有利于臨床醫(yī)生盡早確定病因基因診斷技術不僅在疾病檢測上具有重要意義，而且在婚前檢查，親子鑒定等人類生活方面具備廣闊運用前景,基因診斷的方法,PCR核酸雜交基因芯片(chip)擴增片段長度多態(tài)性(Amp-FLP) 等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法(ASO) 單鏈構象多態(tài)性診斷法 (SSCP),PCR技術的發(fā)明及特點,1985年Saiki 首次用以

6、擴增β珠蛋白基因標志PCR技術的問世。PCR技術具有簡便、快速、特異和靈敏等特點，它用于基因診斷，使之發(fā)生了革命性的變化。PCR技術可使待測樣品中的目的基因片段在幾小時內(nèi)，甚至十幾秒內(nèi)擴增百萬倍，如果標本中原來的目的基因達到fg級水平，就可以通過簡單電泳和溴化乙啶(EB)顯示擴增后的核酸片段區(qū)帶。從檢測區(qū)帶的電泳位置看它是否符合引物設計的擴增長度。,PCR技術的進展,PCR-Southern印跡 模板檢測靈敏度可

7、達ag級水平(可查出幾個病毒的存在)則能看到雜交帶。特點：特異性強，但操作費時間，一次需3d，這使急于根據(jù)檢測結(jié)果決定治療措施的臨床醫(yī)生迫不及待。套式PCR 是指在用第一對引物(外引物)擴增之后，加入另一對位于外引物內(nèi)側(cè)的內(nèi)引物，再行擴增數(shù)十個循環(huán)，這可將標志檢測時間壓縮8-10h，第2日便可獲得高敏感性的檢查結(jié)果。其敏感性大致與PCR-Southern印跡相當。,PCR的微量化 反應體積減少至10

8、-20μl，降低了PCR檢測的成本。在1次PCR中加入多對引物，可用于病毒、細菌等的分型和多種病原體基因的檢測。PCR擴增產(chǎn)物，用專為檢測雙鏈DNA而設計的微量熒光計定量，就可從標準模板DNA的量或拷貝數(shù)達到PCR定量的目的。取樣技術的改進 對于產(chǎn)前診斷，初期是取羊水細胞，需進行細胞培養(yǎng)。從1982年起采取妊娠8-12周的絨毛DNA作產(chǎn)前診斷使產(chǎn)前基因診斷的時間提前。由于PCR技術的應用，甚至在胚胎植入前(受精6d)也可作

9、產(chǎn)前診斷。,反向遺傳學策略 過去尋找致病基因是從經(jīng)典遺傳學思路出發(fā)，先發(fā)現(xiàn)疾病的表現(xiàn)改變，再經(jīng)過不同方法由表型追溯到基因。近幾年來發(fā)展起來的“反向遺傳學”(reverse genetics)在策略上解決了經(jīng)典遺傳學所不能解決的這個難題。在不知道和不必知道基因產(chǎn)物或表型的情況下分離和定位致病基因，并由它的一級結(jié)構推出產(chǎn)物的氨基酸序列。方法：須先采用細胞遺傳學方式或RFLP連鎖分析確定致病基因在染色體上的大概位置，然后采用染色體步移（

10、chromosome walking）或染色體跳躍（chromosome hopping）技術逐漸接近，最后找到的基因的準確位置。成功例子：如Duchenne肌營養(yǎng)不良和囊性纖維變等致病基因的發(fā)現(xiàn)；預計亨廷頓舞蹈病、神經(jīng)纖維瘤、多發(fā)性腸息肉和成人型多囊腎等疾病的致病基因，不久可望用此策略得以確定。,核酸雜交概念,不同來源的DNA加熱變性后，只要兩條多核苷酸鏈的堿基有一定數(shù)量能彼此互補，就可以經(jīng)退火處理復性現(xiàn)象，形成新的雜交體雙螺旋結(jié)構

11、，這種依據(jù)相應堿基配對而使不完全互補的兩條鏈相互結(jié)合稱為分子雜交。,核酸雜交分類,基因探針根據(jù)標記方法不同可粗分為放射性探針和非放射性探針兩大類根據(jù)探針的核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針及寡核苷酸探針等幾類DNA探針還有單鏈和雙鏈之分,核酸探針的標記和檢測,核酸探針的常用酶促標記技術缺口平移DNA快速末端標記用T4多核苷酸酶標記DNA 5‘末端，隨引物延伸聚合酶鏈反應核酸探針的非放射性

12、標記技術光促生物素標記核酸酶促生物素標記核酸寡核苷酸的生物素末端標記酶標DNA酶標寡核苷酸DNA半抗原標記,核酸分子雜交方法,核酸分子雜交可按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應核酸鏈游離在溶液中，固體支持物有硝酸纖維素濾膜、尼龍膜、乳膠顆粒、磁珠和微孔板等。液相雜交所參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。,基因芯片概念,也叫DNA芯片，是在90年代中期發(fā)

13、展出來的高科技產(chǎn)物?；蛐酒笮∪缰讣咨w一般，其基質(zhì)一般是經(jīng)過處理后的玻璃片。每個芯片的基面上都可劃分出數(shù)萬至數(shù)百萬個小區(qū)。在指定的小區(qū)內(nèi)，可固定大量具有特定功能、長約20個堿基序列的分子探針。,基因芯片的原理及用途,原理：由于被固定的分子探針在基質(zhì)上形成不同的探針陣列，利用分子雜交及平行處理原理，基因芯片可對遺傳物質(zhì)進行分子檢測可用于進行基因研究、法醫(yī)鑒定、疾病檢測和藥物篩選等特點：基因芯片技術具有無可比擬的高效、快速和多參量特點

14、，是在傳統(tǒng)的生物技術如檢測、雜交、分型和DNA測序技術等方面的一次重大創(chuàng)新和飛躍,基因芯片應用,基因破譯 ：基因功能；提高測序速度基因診斷 ：癌癥、糖尿病等，借助一小滴測試液，醫(yī)生們能預測藥物對病人的功效，可診斷出藥物在治療過程中的不良反應，還能當場鑒別出病人受到了何種細菌、病毒或其他微生物的感染。,擴增片段長度多態(tài)性,概念：小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱

15、為擴增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP）連鎖分析法。方法：PCR擴增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析。,等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法,當基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide, A

16、SO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時一般需要合成兩種探針，一種與正?；蛐蛄型耆恢拢芘c之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來。PCR可結(jié)合ASO，即PCR－ASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大

17、大簡化了方法，節(jié)約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。,單鏈構象多態(tài)性診斷法,單鏈構象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism, SSCP）是指單鏈DNA由于堿基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或突變的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR

18、擴增，然后將擴增物用甲酰胺等變性，并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異，從而可據(jù)此作出診斷。PCR－SSCP法具有能快速、靈敏地檢測有無點突變或多態(tài)性的優(yōu)點，但如欲闡明突變的堿基性質(zhì)，則需作序列分析。,基因診斷的質(zhì)量控制,特異性：雜交技術是通過基因克隆制備探針來完成，PCR是通過引物來完成，RFLP是利用限制內(nèi)切酶來完成等。即探針、引物、限制性內(nèi)切酶在反應中都具有特異性。靈敏度：雜交技術用同位

19、素或酶標記探針，PCR反復擴增20-30次都是提高靈敏度的手段。二次PCR、PCR與Southern blot合用都是典型的例子。操作簡單：雜交技術因操作復雜且費時（需1-2天以上出結(jié)果），在臨床實驗室難以推廣。而PCR方法相對簡單、快速，故推廣迅速。實驗成本：分子生物學實驗因試劑多數(shù)依賴進口，成本高，給臨床推廣造成一定困難。試劑國產(chǎn)化是今后的努力方向。重復性和穩(wěn)定性,基因診斷的應用,感染性疾病病毒性疾病的診斷：HBV、HCV、

20、HIV和HPV細菌性疾病的診斷：TB、瘧原蟲遺傳性疾病鐮刀狀細胞貧血癥：beta-珠蛋白基因AT變換甲型血友病：凝血因子VIII腫瘤 ras癌基因突變、c-myc癌基因 p53抑癌基因、p16抑癌基因產(chǎn)前診斷、移植配型法醫(yī)鑒定,基因診斷的意義,一是可以解決遺傳性疾病難以診斷的黑洞，由于遺傳性疾病主要是由特定的DNA序列即基因決定的，通過基因診斷能夠在遺傳病患者還未發(fā)現(xiàn)出任何癥狀之前就能確診二是肝炎、癌癥、艾滋病都與病

21、毒有關，而通過基因診斷技術就可以順利檢查出隱藏在人體細胞基因中的病毒從而在造成危害之前消滅它們。,基因治療 (Gene Therapy)的概念,人類疾病的發(fā)生，是人體細胞中自身基因的改變，是由外源病原體的基因產(chǎn)物與人體基因相互作用的結(jié)果。因此，長期以來，科學家設想人類能否最終運用遺傳物質(zhì)，無論是人類自身的或是外源遺傳物質(zhì)來治療疾病，糾正人體本身基因結(jié)構或功能上的錯亂，阻止病菌的 ，殺滅病變的細胞或抑制外源病原體遺傳物質(zhì)的復制，保證人體健

22、康?；蛑委?gene therapy)就是用正?；蛞吧?wild type)基因較正或置換致病基因的一種治療方法。目的基因被導入到靶細胞（target cells）內(nèi)，他們或與宿主細胞（host cell）染色體整合成為宿主遺傳物質(zhì)的一部分，或不與染色體整合而位于染色體外，但都能在細胞中得到表達，起到治療疾病的作用。目前基因治療的概念有了較大的擴展，凡是采用分子生物學的方法和原理，在核酸水平上開展的疾病治療方法都可稱為基因治

23、療。隨著對疾病本質(zhì)的深入了解和新的分子生物學方法的不斷涌現(xiàn)，基因治療方法有了較大的發(fā)展。,基因治療的潛力,基因治療的歷史沿革 1990年，科學家第一次用反轉(zhuǎn)錄病毒為載體，把腺苷脫氨酶基因（ADA）導入來自病人自身的T淋巴細胞，經(jīng)擴增后輸回患者體內(nèi)，獲得可成功。標志著基因治療時代的開始。 1995年美國FDA批準Ad－P53腫瘤基因治療等臨床試驗的實施，標志著基因治療已逐步進入一個正常的、目標明確的理性化發(fā)展階段。,18歲

24、的格爾辛基（Jesse Gelsinger）因臨床試驗的某些失誤而于1999年9月17日死亡。格爾辛基是世界上首位由基因治療導致喪生的患者。他患先天性鳥氨酸甲酰氨基轉(zhuǎn)移酶（OTC）缺乏癥（X連鎖性遺傳?。┎“Y，在男性身上較嚴重，往往引起新生男嬰患者的死亡。2006年7月24日,來自伊利諾斯州的一名36歲女患者，為了治療自己的風濕性關節(jié)炎而采用基因治療的方法,在一條腿的膝蓋部位注射了藥劑結(jié)果死亡,該公司也被迫關閉。,基因治療的前景分析

25、基因治療是將具有治療價值的基因，即“治療基因”裝配于帶有在人體細胞中表達所必備元件的載體中，導入人體細胞，直接進行表達。進行基因治療時毋須對表達產(chǎn)物進行分離純化，因為人細胞本身可以完成這個過程。,可大大降低治療成本。因為基因治療不需要基因工程中耗資最大的器材與材料費用，顯著降低了工業(yè)化的成本。基因工程的“目的基因” 往往不能有效地進入細胞而不能備應用于基因工程。但基因治療不受上述限制。具有治療作用，理論上均可應用于基因治療。因此

26、，基因治療具有更大的潛力。,基因治療則必須將基因直接導入人體細胞，不僅在技術上具有很大難度，而且在有效性于安全性方面提出了風為苛刻的要求?；蛑委焹H有10年的歷史，不少技術還不夠成熟。所以，它所遇到的風險性更大。,基因治療的策略,基因置換（gene replacement）：基因置換就是用正常的基因原位替換病變細胞內(nèi)的致病基因，使細胞內(nèi)的DNA完全恢復正常狀態(tài)。這種治療方法最為理想，但目前由于技術原因尚難達到?；蛐迯停╣ene

27、 correction）：基因修復是指將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。這種基因治療方式最后也能使致病基因得到完全恢復，操作上要求高，實踐中有一定難度。,基因修飾（gene augmentation）又稱基因增補，將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌毎康幕虻谋磉_產(chǎn)物能修飾缺陷細胞的功能或使原有的某些功能得以加強。在這種治療方法中，缺陷基因仍然存在于細胞內(nèi)，目前基因治療多采用這種方式。如將組織型纖溶酶原激活劑的基因?qū)胙?/p>

28、內(nèi)皮細胞并得以表達后，防止經(jīng)皮冠狀動脈成形術誘發(fā)的血檢形成基因失活（gene inactivation）：利用反義技術能特異地封閉基因表達特性，抑制一些有害基因的表達，已達到治療疾病的目的。如利用反義RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的分化。用此技術還可封閉腫瘤細胞的耐藥基因的表達，增加化療效果。,免疫調(diào)節(jié)（immune adjustment）：將抗體、抗原或細胞因子的基因?qū)爰踩梭w內(nèi)，改變

29、病人免疫狀態(tài)，達到預防和治療疾病的目的。如將白細胞介素-2導入腫瘤病人體內(nèi)，提高病人IL-2的水平，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性，達到防治腫瘤復發(fā)的目的。其它：增加腫瘤細胞對放療或化療的敏感性：采用給予前體藥物的方法減少化療藥物對正常細胞的損害。如向腫瘤細胞中導入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后給予病人無毒性GCV藥物，由于只有含HSV-TK基因的細胞才能將CGV轉(zhuǎn)化成有毒的藥物。因而腫瘤細胞被殺死，而對正常細胞無影響。耐藥基因治

30、療：將產(chǎn)生抗藥物毒性基因如MDR-1導入干細胞中，使機體耐受更大劑量的化療或放療,遺傳性疾病基因治療策略,隱性遺傳病 用正常基因置換致病基因而達到完全校正導入正?；蛐蛄幸赃_到暫時性校正顯性遺傳病用正常基因置換致病基因而達到完全校正使有害基因失活而達到暫時性校正（如用反義技術、核酶等）在某些情況下可導入正常基因加以校正（如LDL受體）,低密度脂蛋白受體,疾病基因治療策略,腫瘤殺傷腫瘤細胞：利用自殺基因，激活免疫系統(tǒng)及保護正

31、常細胞免受化療藥物的損傷等使癌基因失活（反義技術、核酶）增加抑癌基因的表達傳染病殺傷傳染源（免疫法、自殺基因） 使傳染源失活（反義技術、核酶、核酸陷井）其它疾病導入藥物基因（藥物釋放）如激素、細胞因子失活、有害基因產(chǎn)物（反義技術、核酶、核酸陷阱）殺傷策略如減少特異細胞群,體細胞基因治療(somatic cell gene therapy)的途徑Ex vivo – cells removed from body, inc

32、ubated with vector and gene-engineered cells returned to body.In situ – vector is placed directly into the affected tissues.In vivo – vector injected directly into the blood stream.,咨詢,體細胞,半乳糖血癥,飲食的,苯丙酮尿癥,抗瘧疾藥物,甲狀腺素,甲狀

33、腺低能癥,苯甲酸酯,降膽固醇藥,吡哆醇,高胱氨酸尿,脫氨酶,戈謝病,葡萄糖腦苷脂病,炎癥或肉芽腫性,地中海貧血,基因治療的障礙1. 基因治療載體的建立2. 治療基因的構建3. 受體細胞的增殖與維持有效的基因轉(zhuǎn)移技術使DNA進入受體細胞核內(nèi)并整合到染色體基因組中4. 經(jīng)基因轉(zhuǎn)移后的治療用細胞的增殖和向病人的移植,治療基因在細胞內(nèi)的命運,實驗室基因治療研究,疾病的遺傳背景及機制的揭示可選治療基因的篩選及評價基因治療藥物的制備治

34、療用目的基因基因轉(zhuǎn)移及表達載體接受基因轉(zhuǎn)移的細胞基因轉(zhuǎn)移的方法途徑的選擇基因治療效果的評估基因治療藥物的安全性評估,臨床人體基因治療的基本程序,疾病的評估目的基因的選擇和制備基因的轉(zhuǎn)運載體基因治療藥物的制備受體靶細胞的選擇細胞轉(zhuǎn)染(transfection)或感染(Infection)外源基因的表達及檢測基因治療的療效評價基因治療的安全性及倫理學,基因治療所應用的治療基因,基因治療的載體系統(tǒng),RNA病毒載體(反

35、轉(zhuǎn)錄病毒)RNA viruses (Retroviruses)1. 鼠白血病病毒 Murine leukemia virus (MuLV)2. 人免疫缺陷病毒 Human immunodeficiency viruses (HIV)3. 人T淋巴細胞病毒 Human T-cell lymphotropic viruses (HTLV) 4. 慢病毒 Lentinovirus,DNA病毒載體 DNA virus

36、es1. 腺病毒Adenoviruses2. 腺相關病毒Adeno-associated viruses (AAV)3. 單純胞疹病毒Herpes simplex virus (HSV)4. 痘病毒Pox viruses5. 濾泡病毒Foamy viruses,非病毒載體Non-viral vectors1. 脂質(zhì)體Liposomes2. 裸DNA Naked DNA3. 脂質(zhì)體-聚陽離子復合物Lip

37、osome-polycation complexes4. 多肽傳遞系統(tǒng)Peptide delivery systems,病毒載體的類型,重組型病毒載體(Recombinant virus vectors)以完整的病毒基因組為改造對象。一般的步驟是選擇性地刪除病毒的某些必需基因尤其是早期基因，或控制其表達；缺失的必需基因的功能由互補細胞反式提供；用外源基因表達單位替代病毒非必需基因區(qū)；病毒復制和包裝所需的順式作用元件不變。通過同源

38、重組方法將外源基因表達單位插入病毒基因組中。如在傳統(tǒng)的重組腺病毒構建方法中，將外源基因表達盒（Exogenous gene expression cassette）插入穿梭質(zhì)粒（如pXCX2或pFGdX1）的腺病毒同源序列中，與輔助質(zhì)粒（含有腺病毒基因組的質(zhì)粒如JM17或pBHG）共轉(zhuǎn)染293細胞，通過細胞內(nèi)的同源重組獲得含有外源基因的重組腺病毒（Graham FL and Prevec L 1995）。,無病毒基因的病毒載體（Gutl

39、ess vectors）在不同的病毒載體系統(tǒng)中的稱謂不同。對于腺病毒，一般稱為mini-Ad；在HSV載體系統(tǒng)，一般稱為擴增子（Amplicon）載體或質(zhì)粒型載體。重組AAV載體也屬于無病毒基因的病毒載體。由載體質(zhì)粒和輔助系統(tǒng)組成。重組載體質(zhì)粒主要由外源基因表達盒、病毒復制和包裝所必需的順式作用元件及質(zhì)粒骨架組成。輔助系統(tǒng)包括病毒復制和包裝所必需的所有反式作用元件。在輔助系統(tǒng)的作用下，重組載體質(zhì)粒（包含或不包含質(zhì)粒骨架）以特定形

40、式（單鏈或雙鏈，DNA或RNA）被包裝到病毒殼粒中，其中不含有任何病毒基因。優(yōu)點在于載體病毒本身安全性好，容量大。缺點在于往往需要輔助病毒參與載體DNA的包裝，而輔助病毒又難以同載體病毒分離開來，造成最終產(chǎn)品中輔助病毒污染，從而影響其應用。,基因治療臨床試驗采用的載體系統(tǒng),病毒載體的順式作用元件和經(jīng)典包裝方式,常用病毒載體的特性和適用范圍,Advantages:Randomly integrates into genomeWide

41、 host rangeLong term expression of transgeneDisadvantages:Capacity to carry therapeutic genes is smallInfectivity limited to dividing cellsInactivated by complement cascadeSafety,Life cycle of a retrovirus,Gene the

42、rapy constructs maintained at this stage.,,Adenovirus,Advantages:Efficiency of transduction is highHigh level gene expressionSlightly increased capacity for exogenous DNADisadvantages:Expression may be transientCel

43、l-specific targeting difficult to achieveVirus uptake is ubiquitousSafety,Other viral vectors,Adeno-associated virus – infects wide range of cells (both dividing and non-dividing), able to integrate into host genome, n

44、ot associated with any human disease, high efficiency of transduction.Herpes simplex virus, vaccinia virus, syndbis virus, foamy viruses – not yet widely studiedOnyx virus – limited replicating adenovirus that replicat

45、es mainly in tumor cells.,1. Liposome,2. Cationic polymers,Non-viral vectors,May overcome limitations with viruses including small capacity for therapeutic DNA, difficulty in cell-type targeting and safety concerns.,4.

46、 Peptide-mediated gene delivery,3. Naked DNA,Steps in synthesis of a therapeutic gene therapy gene construct,Arrangement of native retrovirus genome,,Synthesis of a retroviral gene therapy vector,,Site of insertion of

47、therapeutic gene,基因轉(zhuǎn)移方法系統(tǒng),基因轉(zhuǎn)移的篩選系統(tǒng),陽性選擇系統(tǒng)隱性基因互補作用基因胸腺嘧啶激酶基因(thymidine kinase gene, tk) 二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolic reductase gene, dhft) 次黃嘌呤、鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移基因(hypoxanthine guanine phoshporibosyl-transferase gene, hgpt)氨基甲酰磷

48、酸合成酶－天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶－二氫乳清酸酶(CAD) 鳥氨酸脫羧酶(GDC),顯性抗性基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(neomycin phoshpotransferase gene, neo) 黃嘌呤、鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因(xanthine guanine phosphoribosyl-transferase gene, xgprt) 腺嘌呤核苷脫氨酶(adenosine deaminase, ada) 天冬酰胺合成酶(a

49、sparagines synthetase gene, as) 多藥物抗性基因(human multidrug resistance gene, mdrⅠ),濕霉素-B-磷酸轉(zhuǎn)移酶(hygromycin resistant gene, hph) 突變的二氫葉酸還原酶(mDHFR)金屬硫蛋白基因(MT) 腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(adenine phosphoribosyl-transferase gene, aprt) 色氨酸

50、合成酶基因(trytophane synthase gene) 組氨醇脫氫酶基因(histidinol dehydrogenase gene, hisD) 烏本苷抗性基因(ouabain resistant gene, ouar),陰性選擇系統(tǒng)在負性選擇系統(tǒng)中，攜帶某個活性基因的細胞在選擇培養(yǎng)基中被殺死，而不帶有該基因，或該基因因為各種原因被滅活的細胞則存活下來，其作用機理是某基因產(chǎn)物對細胞有毒性或者能將培養(yǎng)液中的一些成分轉(zhuǎn)變?yōu)閷?/p>

51、細胞有毒性的物質(zhì)。有時此類基因也稱為“自殺性基因”，被用于腫瘤的基因治療中。胞嘧啶脫氨酶基因(cytosine deaminase gene, CD) 胸苷激酶基因(thymidine kinase gene, tk ) 白喉毒素A鏈基因(diphtheria toxin A chain gene, DT-A),轉(zhuǎn)移基因的表達,治療基因的表達水平治療基因的持續(xù)時間治療基因的可調(diào)控表達治療基因的組織特異性表達基因表達的檢測,

52、基因表達誘導系統(tǒng),靶向基因治療,基因治療的理想：修復突變基因，恢復正常的基因表達及其調(diào)控機制現(xiàn)行基因治療：附加基因或其表達產(chǎn)物的治療，故又稱基因替代療法靶向基因治療的意義：選擇性針對患病組織細胞選擇性針對突變基因：突變基因的原位修復減少不必要的副作用，提高安全性,轉(zhuǎn)移基因的同源重組,轉(zhuǎn)移DNA 細胞核 染色體整合 附加體形式隨機整合(常見)

53、 同源重組(稀有),,,,,,基因修復：鑒定并修復錯誤基因,基因靶向治療的策略,逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的靶向基因轉(zhuǎn)移,一、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導的細胞類型的選擇調(diào)節(jié)1、改變Mo-HLV感染譜 按宿主范圍可將Mo-HLV分為三類：單向性：只能感染嚙齒類細胞；異向性：可感染除嚙齒類動物細胞以外的其它的細胞；雙向性：可感染人及嚙齒類動物等大多數(shù)細胞。感染細胞的類型是由病毒的外殼蛋白env確定的。（1）病毒與抗體的偶聯(lián)：為了使逆轉(zhuǎn)錄病毒定向感染

54、所需要的靶細胞，可將病毒與抗體偶聯(lián)，該抗體則針對所需感染細胞上特有的抗原。如使單向感染病毒與抗人MHC-1。MHC-II的抗體偶聯(lián)或與抗人表皮生長因子的抗體偶聯(lián)后，可以感染人類細胞。Goud等使用此法使單向病毒感染人的肝細胞，可惜病毒未能整合入肝細胞基因組，可能其中還有其它原因。,（2）病毒外殼蛋白與配體偶聯(lián)：  如將env蛋白與乳糖偶聯(lián)成去延酸糖蛋白，用此法改造的單向逆轉(zhuǎn)錄病毒將不再感染原先的宿主而只感染人的肝細胞，因為只有

55、肝細胞表面上含有去延酸糖蛋白的受體。 （3）改變病毒外殼蛋白的識別序列：已發(fā)現(xiàn)env蛋白與被感染細胞受體相識別部位的化學組成，如果改變核表位的基因序列，就可能改變感染細胞的類型，但Etienne等認為有一個潛在的、非病毒原有的表位與細胞受體識別之后不能使病毒內(nèi)化。一種可行的方法是同時表達原有的env蛋白，就能解決內(nèi)化問題。,2、使用其它逆轉(zhuǎn)錄病毒載體： 牛白血病逆轉(zhuǎn)錄病毒，猿免疫缺陷病毒，鼠乳腺腫瘤病毒有組織專一性感染的特點

56、，有些研究組利用其作為載體。Page等采用HIV作為病毒載體，Rizvi等用BLV作載體，Morris等采用MMTV作載體，并構建了MMTV獨特的包裝細胞，使病毒滴度提高百倍以上，但同Mo-MLV相比，其它病毒的滴度偏低。,3、以嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒感染譜是由病毒顆粒決定的，改變病毒顆粒蛋白，即env基因改變感染宿主范圍。Laudau等用鳥逆轉(zhuǎn)錄病毒和RSV的env基因取代 Mo-MLVR env基因，Miller

57、等用長臂猿白血病病毒的env基因嵌合 Mo-MLVR成功感染了多種細胞，并取得較高的滴度Gong等用流感病毒的血凝素取代RSV的env基因蛋白，將血凝素成功地嵌入病毒外殼，并能有效感染人和鳥類細胞Jane等用泡狀口炎病毒G糖蛋白取代莫洛尼病毒env蛋白，使該病毒顆粒能成功地感染非哺乳動物如Zebra fish細胞，更重要的是這種病毒外殼可耐受超離心而不影響感染效率，因此有利于濃縮病毒，提高滴度。,目的基因組織專一性表達的調(diào)節(jié),1、肝

58、專一性表達肝專一性表達多采用磷酸烯醇式酮酸羧激酶的啟動子。McGrane  等用了轉(zhuǎn)基因動物技術使該啟動子表達外源基因，證明該啟動子專一性地在肝和腎等中表達；Hatzoglau等用PEPCK啟動子與neo基因或牛生長因子重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體?？寺『蠼?jīng)腹腔注射入子宮感染鼠胎肝或注入門靜脈并切除部分肝，證實前病毒可整合肝細胞基因組，并持續(xù)表達了八個月之久，而且牛生長因子表達量受食物刺激信號的調(diào)節(jié)。,另一個肝專一性表達的片段是A-

59、胰蛋白酶基因的順式作用因子。Simon等的研究表明，α-AT基因上游是決定肝專一性表達的片段，（-137～37）為最短的肝專一性表達的片段。Peng等用α-AT的（-730-30）片段與SV40啟動子融合驅(qū)動人苯丙氨酸羥化酶基因，使其在肝臟專一性表達，為苯丙酮尿癥基因治療奠定了基礎。,α-FP為肝癌細胞特有的高效表達產(chǎn)物，Watanabe等發(fā)現(xiàn)其上游調(diào)控區(qū)（-3700～3300）決定了α-FP在肝癌中的專一性表達。Huber等將片段與你

60、腺嘧啶激酶基因融合，克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒后轉(zhuǎn)染肝細胞，然后給予無毒性原藥-阿拉伯糖核苷，只有肝癌細胞才專一性地合成TK，Pro-ara-MF轉(zhuǎn)化成細胞毒性ara-ATP，造成肝癌細胞的死亡，而其它感染了α-EF-TK的細胞不受影響。,受體介導靶向基因治療,,2、肌肉專一性表達 肌肉中高效表達的是肌苷激酶的調(diào)控片段。Johnson等發(fā)現(xiàn)MCK調(diào)控區(qū)有兩個增強子：一個位于（-1256～1049），決定肌肉和心肌專一性表達，另一個位于第一內(nèi)含子

61、（738～1599），只決定在心肌的高效專一性表達。Cox等用這兩個增強子使Dystrophin在肌肉的表達量增強50倍，完全糾正了mdr鼠肌肉病理變化，而且無付作用，最近，Yao等用2分MCK增強子（-1350～1048）使人凝血因子IX在肌母細胞中得到高效表達。3、乳腺專一性表達 在乳腺中專一性表達的基因有β酪蛋白，乳清酸蛋白，鼠乳腺腫瘤病毒，三都調(diào)控區(qū)中的負調(diào)控片段決定他們僅在乳腺組織中表達。,4、黑色素瘤專一性表達 黑色

62、素瘤特異性表達酪氨酸和酪氨酸相關蛋白。決定酪氨酸專一性表達的片段是在該基因上游（-270～1），決定TRP-1專一性表達的區(qū)域為（-640～165），Hart等用上述調(diào)控區(qū)與Gal報告基因融合，在人與鼠的黑色素瘤細胞中均檢測到其表達。5、膠質(zhì)瘤專一性表達 目前已知鞘磷酸堿性蛋白基因上游（-1300～1）片段決定其在膠質(zhì)瘤細胞中的專一性表達，Miyao等用該片段與HTK基因融合，轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞，在1μMganciclovir培養(yǎng)液中

63、，90%膠質(zhì)瘤細胞死亡，而對照組生長不受影響。6、肺癌專一性表達 人表面活性蛋白A是大多數(shù)肺癌表達的物質(zhì)。Smith 等用SPA-1上游（-2600～178）片段驅(qū)動HSV-TK基因，轉(zhuǎn)化肺癌細胞株H441 ，給予ganciclovir后，H441大量死亡。,基因治療當前的應用,基因治療的例子,遺傳病Adenosine deaminase gene transfer to treat Severe Combined Immuno

64、-Deficiency (SCID)CFTR gene transfer to treat Cystic Fibrosis (CF)Advanced Central Nervous System (CNS) MalignancyMesotheliomaOrnithine Transcarbamylase DeficiencyHemophiliaSickle Cell Disease癌癥肺癌：p53乳腺癌：BRAC1前

65、列腺癌：p53肝癌：IFNaCNS腫瘤：TK等自殺基因,One developing technology that may be utilized for gene therapy is nuclear transfer (“cloning”).,基因治療的未來技術：核轉(zhuǎn)移,干細胞技術應用于基因治療,免疫技術應用于基因治療,基因治療的安全性,患有罕見的單基因遺傳病的Gelsinger是美國首位明確由基因治療導致喪生的患者。200

66、0年3月7日，為進一步加強臨床試驗監(jiān)查力度，F(xiàn)DA和NIH公布了兩項新措施：（1）制定了基因治療臨床試驗臨查計劃；（2）定期開辦基因治療安全性專題研討會。,基因治療的倫理學問題,將基因治療于非疾病情形如增強機能或“化妝”目的基因治療用于治療禿發(fā)：將生發(fā)相關基因?qū)朊壹毎袑⑸L激素基因?qū)胍鹁奕水a(chǎn)生將營養(yǎng)基因?qū)胍栽黾蛹∪膺_到健美目的胚胎體細胞基因治療只有確切證實的嚴重遺傳病，在權衡利弊后才進行胚胎體細胞基因治療克隆和