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文檔簡介
1、RNA提取及PCR相關(guān)實驗技術(shù),RNA提取逆轉(zhuǎn)錄實驗步驟結(jié)果分析PCRqPCR,內(nèi)容,從RNA提取到基因定性/定量流程,收集并保存組織、血液、細胞等臨床樣本,,,,樣本保存要求最好使用新鮮樣品組織:取樣離體后,立即分成1cm3左右的小塊, 每塊約30-100mg,放入凍存管或錫箔紙包好, 立即放置液氮罐中速凍1小時,-80℃冰箱保存。注意做
2、好標記,避免反復凍融,第一部分 RNA提取,RNA提取樣本保存要求,細胞:不建議保存。 培養(yǎng)處理后立即提取RNA, 或收集后,于Trizol液中- 80 ℃保存。血液:不建議長期保存。 或立即分離白細胞后,于Trizol液中 - 80 ℃保存。,試劑耗材準備工作,目的:去除RNase,防止RNA降解? 各種離心管、Tip頭、冷凍保存
3、管等塑料器皿:浸泡在0.1%的DEPC水中,過夜處理,次日烘干,高壓滅菌后再次烘干。? 錫箔紙、玻璃勻漿管、研缽、手術(shù)剪刀、鑷子、移液管等玻璃、金屬及陶瓷制品: 用錫箔紙嚴密包裹后,150℃高溫烘烤4小時。,前期準備工作,? RNase-free水:0.1%DEPC處理去離子水過夜,次日高壓滅菌除去 殘留DEPC,分裝1.5ml Eppend
4、orf管, 4℃保存。? 75%乙醇:用RNase-free水配制,分裝為50ml,4℃保存。? 氯仿、異丙醇、無水乙醇:新包裝開封后,分裝50ml,4℃保存。注意:DEPC有吸入毒性,需穿工作服,戴手套、口罩操作。,樣本準備,組織,50-100mg 組織對應1ml Trizol,樣本準備,細胞 ? 懸浮細胞:生長對數(shù)期誘導后, 5000×g,5min離心去 除培養(yǎng)基,收集約5 - 10&
5、#215;106個細胞。 每5 - 10×106個細胞對應1ml Trizol ? 貼壁細胞:生長對數(shù)期誘導后,收集約5 - 10×106個細 胞,倒掉培養(yǎng)基,加入預熱PBS洗一次,去 除PBS。 每10cm2培養(yǎng)面積對應1ml Trizol,RNA的提取,注意佩戴口罩、勤更換手套 組織(1)液氮
6、預冷研缽;(2)液氮研磨,至樣品呈粉末狀(需8-10min);(3)向研缽內(nèi)加入1ml Trizol繼續(xù)研磨,至呈不黏稠液態(tài);(4)將混合液轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器中,冰上勻漿3min;(5)將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管,室溫孵育5min;,裂解,,,,RNA的提取,細胞 懸浮細胞:離心收集后,倒除培養(yǎng)液,加入1ml Trizol 反 復吹打細胞,至溶液
7、不黏稠。 貼壁細胞:倒除培養(yǎng)液,PBS洗滌一次后,直接在培養(yǎng) 瓶或培養(yǎng)板中加入1ml Trizol 反復吹打細胞, 直至溶液不黏稠。室溫孵育混合液10min后,轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管,裂解,,,,Trizol勻漿孵育后,RNA提取優(yōu)化步驟,(1)對得率較低的樣本,可在異丙醇沉淀一步,選用-20
8、 度過夜孵育,以增加得率。(2)對多糖含量較高的樣本,可在異丙醇沉淀一步,加入 高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl), -20度過 夜共孵育,以去除多糖物質(zhì)的污染。注意:所有試劑均需無酶水配制。,RNA鑒定及初定量,(1)測量OD值——得率及純度檢測 得率 總RNA濃度(ug/ml)=OD260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml
9、 (通常OD260 數(shù)值介于0.15-1.0之間才可靠) 純度 OD260/280檢測RNA純度 值在1.8-2.1之間,RNA純度較好; 值小于1.8,表明蛋白雜質(zhì)較多; 值大于2.2,表明RNA已降解;,RNA鑒定及初定量,(2)瓊脂糖凝膠電泳——RNA完整性鑒定
10、 1-3ul RNA溶液上樣,1%膠,100V電泳10min。完整RNA呈現(xiàn)明顯兩條帶28S,18S,且28S帶約為18S帶亮度的兩倍;有時也可見5S帶,RNA鑒定及初定量,Electrophoresis gel of the RNA sample,小結(jié)-RNA的保護,1. 提取前 1.1 新鮮樣品及液氮速凍 1.2 提取工作區(qū)RNase的清除 1.3 實驗用品RNase的清除
11、 2. 提取中 2.1 組織破碎過程中的保護 2.2 細胞裂解過程中的保護 2.3 實驗人員保護措施 2.4 保存過程中,3. 在后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄過程中仍需保持無酶環(huán)境,第二部分 RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄,? 選擇方法: 兩步法(適用于多目的基因) 一步法(適用于單一目的基因),RNA逆轉(zhuǎn)錄,? 選擇逆轉(zhuǎn)錄引物:隨機
12、引物(適用于低豐度RNA) Oligo (dT)引物(適用于具有Poly A尾的RNA) 特異性引物 (適用于一步法),RNA逆轉(zhuǎn)錄步驟,(1)取1-5ug RNA樣本,65℃熱變性10min;(2)配制反應體系,共20ul (以AMV為例)10×buffer
13、 2 ulMgcl2 (25mM) 4 uldNTPs (10mM) 2 ulRNase inhibitor(1U/ul) 0.5 ulreverse transcriptase 15 Ureverse primer 0.5 ugRNA sample
14、 1 -5ugRNase-free Water 加至 20 ul,一、逆轉(zhuǎn)錄反應,RNA 逆轉(zhuǎn)錄步驟,(3)反應體系42℃孵育60min。如使用隨機引物,先室溫孵育 10min后,再升溫至42℃。(4)72℃,5min失活酶,置冰進行后續(xù)反應或-20 ℃保存。cDNA第一鏈已合成,可低溫保存或繼續(xù)后續(xù)實驗,,聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)
15、以母鏈DNA為模板,以特定引物為延伸起點,以反應底物脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)在DNA聚合酶催化下,通過變性、退火、延伸等步驟,體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。,PCR的原理和反應過程,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR,PCR反應準備工作: ? 目的基因擴增引物設計:NCBI中查詢靶基因的mRNA序列,無特 殊要求可選擇CDS序列作為引物設計區(qū)域。,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR,? mRNA序列查找(以E
16、GFR為例),,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR,…………,…………,…………,以BLAST驗證引物,,,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄PCR,PCR反應準備工作: ? 選擇內(nèi)參: 1. 受不同實驗處理因素時,表達恒定; 2. 在體內(nèi)各種組織中表達恒定; 3. 除實驗設計處理因素之外,能夠與目的基因 一起受同等程度的非設計其它
17、因素影響。 常用內(nèi)參基因名稱: β-actin、 GAPDH、16Sr、18Sr (Human 、Rat 、 Mouse),RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄步驟,二、PCR擴增(示例),cDNA第一鏈 2 ul10×PCR buffer(K+) 5 ul25mM MgCl2
18、 3 ul (1.5 mM)10mM dNTPs 1 ul (各200 uM)50μM引物 正向/ 反向 各0.5 ul (0.1~0.5 uM)Taq 酶 0.5 ul (1~5U)雙蒸水
19、 38.5 ul總反應體積: 50 ulPCR mix包含:buffer(Mg2+) dNTPs Taq酶,RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄步驟,PCR反應條件95 ℃ 2 min95 ℃ 30 sec40-65 ℃10-120 sec22-35cycle72 ℃60-120 sec72 ℃ 10min12 ℃
20、 ∞退火溫度:引物的退火溫度一般要比估計的相應熔點溫度Tm低5℃左右。兩條引物的退火溫度相差不應超過4-6℃。特異性的改進:提高退火溫度(比建議退火溫度提高2-5℃);減少退火時間。過長的退火時間在正常情況下并不能提高產(chǎn)量,只會增加非特異性引物雜交的可能性。,,注意事項,(1)每次PCR設立對照組和陰性對照組。(2)科學做法是將內(nèi)參引物加入目的基因的PCR擴增反應體系中,同時擴增作為對照。(3)將反應體
21、系中的相同試劑預先混合,再分裝成各 反應管。(4)設定合適的循環(huán)次數(shù),PCR不能進入平臺期。(5)在一定范圍內(nèi)調(diào)整Mg2+濃度、引物濃度、退火溫 度,消除非特異性擴增。,結(jié)果鑒定,瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果: 2%瓊脂糖凝膠,取4-8 ul產(chǎn)物上樣,60V電泳40min, 紫外燈下觀察結(jié)果。 采用凝膠圖像分析系統(tǒng),對電泳條帶進行密度掃描,測定灰度值。注意:灰度掃描
22、時,選擇合適的膠空白區(qū)域作為扣除的 背景灰度值。,基因表達的差異分析-相對定量,各反應體系以內(nèi)參基因為參照,計算待測基因產(chǎn)物與其灰度比值,作為待測基因的表達值。即待測基因產(chǎn)物電泳帶灰度值內(nèi)參基因產(chǎn)物電泳帶灰度值 雙標準曲線法:待測樣本基因相對表達量 參照樣本基因相對表達量,,=,待測基因相對表達量,,結(jié)果示例,,結(jié)果示例,熒光定量PCR (Real
23、-time PCR, qPCR),PCR + 熒光探針/ 熒光染料①應用廣泛:可用于DNA和RNA的PCR產(chǎn)物定量、基因表達 研究、病原體檢測及PCR條件的優(yōu)化等。②可定量原理:經(jīng)激光激發(fā)后熒光量隨PCR循環(huán)而累積,從而 達到定量目的。③無須凝膠電泳:只須反應管內(nèi)直接檢測。④減少污染環(huán)節(jié):全封閉反應管。 ⑤結(jié)果重現(xiàn)性
24、好:定量動態(tài)范圍高達五個數(shù)量級。,Real-time PCR,相同模板進行96次擴增的擴增曲線圖,起始拷貝數(shù)越高,Ct值越??;起始拷貝數(shù)越低, Ct值越大,與DNA結(jié)合時發(fā)光,游離時不發(fā)光,一種DNA小溝結(jié)合染料,1.SYBR? Green I,熒光染料,在PCR過程中染料與DNA結(jié)合發(fā)光,聚合完成,聚合開始,SYBR? Green I,每形成一個DNA雙鏈,就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去染料一結(jié)合,就產(chǎn)生熒光信號信號強度與DNA分子總
25、數(shù)目成正比,數(shù)量關(guān)系,一條探針,兩條引物 引物位于探針的兩邊一條探針,兩個基團 前邊是報告基團,后邊是淬滅基團,2.TaqMan探針/水解探針,每產(chǎn)生一條DNA鏈,就切斷一條探針每切斷一條探針,就產(chǎn)生一個單位信號信號強度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比,數(shù)量關(guān)系,Real-time PCR反應體系,cDNA第一鏈 2 ul10μM引物 正向/ 反向 各1 ul (0
26、.1~0.5 uM)2×SYBR Green qPCR Mix 10ul 雙蒸水 7 ul 總體積 20 ulSYBR Green qPCR Mix包含: SYBR Green 、buffer(Mg2+)、
27、 dNTPs、 Taq酶,Real-time PCR的定量方式,絕對定量:通過定量標準曲線來確定起始模板的拷貝數(shù);相對定量:用來確定經(jīng)過不同處理的樣品目標轉(zhuǎn)錄本之間的表 達差異或是目標轉(zhuǎn)錄本在不同時相的表達差異。結(jié)果分析△ △Ct法:目的基因與管家基因(內(nèi)參)擴增效率
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