免疫磁珠捕獲技術(shù)結(jié)合環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測鼠疫耶爾森氏菌的研究.pdf

1、鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌（以下簡稱鼠疫菌）引起的一種烈性傳染病，其具有傳染性強(qiáng)、病死率高、傳播速度快、自然疫源性等諸多特點(diǎn)。人類歷史上，曾經(jīng)發(fā)生過三次鼠疫大流行，引起數(shù)以億計(jì)人死亡，給人類帶來過沉重災(zāi)難。在我國，鼠疫被列為甲類傳染病。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，鼠疫疫情雖已得到有效控制，但近年來，動(dòng)物間鼠疫的流行區(qū)域不斷擴(kuò)大，人間鼠疫病例呈上升態(tài)勢。與此同時(shí)，鼠疫菌作為一種典型的生物戰(zhàn)劑及生物恐怖制劑，時(shí)刻威脅著人類的安全。由此可見，鼠疫

2、的監(jiān)控對(duì)人類健康安全、經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定具有重要意義。
　　眾所周知，對(duì)鼠疫菌快速、有效的檢測是控制其傳染的重要手段。目前，對(duì)鼠疫菌的常規(guī)檢測主要包括細(xì)菌學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測、分子生物學(xué)檢測等。細(xì)菌學(xué)檢測一般分四步進(jìn)行——顯微鏡鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)、鼠疫噬菌體裂解實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。該方法耗時(shí)長、需要大量人力物力，不適用于鼠疫菌大量篩查及現(xiàn)場檢測。分子生物學(xué)檢測，即通過體外擴(kuò)增特異性的核酸片段實(shí)現(xiàn)對(duì)鼠疫菌的檢測，該方法雖然具有快速、靈敏、特異

3、等優(yōu)點(diǎn)，但其往往需要特定儀器才能進(jìn)行，且價(jià)格昂貴，操作不便。因此，不適用于偏遠(yuǎn)地區(qū)實(shí)驗(yàn)室及野外檢測。免疫學(xué)方法是一種基于抗原抗體特異性反應(yīng)的檢測方法，主要以膠體金、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等方法為代表。這些方法具有操作簡便、安全性高、特異性好且靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，但在檢測前一般都需要進(jìn)行增菌培養(yǎng)，耗費(fèi)大量時(shí)間，并且該方法抗干擾能力較差。因此，建立一種可快速、高效、適用于偏遠(yuǎn)地區(qū)，且抗干擾能力強(qiáng)的檢測方法十分重要。
　　環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（

4、loop-mediated isothermal amplification of DNA,LAMP）是由Notomi等人于2000年報(bào)道的一種分子生物學(xué)檢測新技術(shù)。此技術(shù)針對(duì)靶基因的4—6個(gè)特異性區(qū)域，分別設(shè)計(jì)特異性引物，在一種具備鏈置換活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，在恒溫條件即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因快速、高效、特異性檢測。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)過程中會(huì)形成大量的、白色焦磷酸鎂（Mg2P2O7）沉淀，因此，可

5、通過肉眼或運(yùn)用實(shí)時(shí)濁度儀檢測沉淀生成量的多少來判斷擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行的程度。若在反應(yīng)前向反應(yīng)體系中加入鈣黃綠素這種復(fù)合熒光素，則可通過肉眼直接觀察反應(yīng)體系顏色是否由黃色變?yōu)榫G色來判斷反應(yīng)是否發(fā)生。
　　實(shí)際檢測中，待檢樣本通常是復(fù)雜的混合物，多種雜質(zhì)往往會(huì)對(duì)檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，難于直接進(jìn)行檢測。免疫磁珠技術(shù)(immunomagnetic beads techniquces)能將靶標(biāo)物與雜質(zhì)分離，從而實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)物的富集。免疫磁珠技術(shù)是20世紀(jì)

6、70年代興起的一種基于免疫學(xué)原理的分離技術(shù)。此技術(shù)是一種利用具有超順磁性的磁性微球作為載體對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行捕獲、富集的生物學(xué)技術(shù)。這種具有超順磁性的微球在經(jīng)過一系列活化后，并與生物基團(tuán)或者生物配體有效地結(jié)合在一起才可形成免疫磁珠，實(shí)現(xiàn)對(duì)待檢物的特異性分離。
　　本研究將免疫磁珠分離技術(shù)(immunomagnetic separation,IMS)與環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplifica

7、tion of DNA, LAMP)相結(jié)合，以LAMP特異性檢測為基礎(chǔ)，以磁珠捕獲DNA或免疫磁珠捕獲菌體為條件，分別建立了磁珠捕獲DNA法結(jié)合環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測鼠疫菌以及免疫磁珠捕獲菌體法結(jié)合環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測鼠疫菌。分別對(duì)兩種檢測方法的LAMP檢測體系、磁珠捕獲體系、免疫磁珠制備體系進(jìn)行優(yōu)化，以及分別對(duì)每種方法的靈敏度、特異性、抗干擾能力、實(shí)際樣本應(yīng)用等多個(gè)方面均進(jìn)行了全面的評(píng)價(jià)。
　　本研究基于鼠疫菌3a保守

8、序列，設(shè)計(jì)LAMP引物，并以擴(kuò)增效率、特異性為標(biāo)準(zhǔn)從設(shè)計(jì)出的多組引物中篩選出最佳引物。并以篩選出的最佳引物為基礎(chǔ)，對(duì)LAMP反應(yīng)體系中，Bst DNA聚合酶加入量、dNTPs加入量、鎂離子濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終建立了25μl體積的LAMP反應(yīng)體系，具體為：10×Thermopol buffer2.5μl，MgSO4(100mM)1.5μl，dNTP MIX(2.5mM)14μl，F(xiàn)IP(100mM)0.4μl，BIP(100mM

9、)0.4μl，F(xiàn)3(10mM)0.5μl，B3(10mM)0.5μl，LF(10mM)0.2μl，Bst DNAPolymerase,Large Fragment(8,000U/ml)1μl，水3μl，模板1μl。65℃反應(yīng)60min。并對(duì)建立的LAMP反應(yīng)體系在鼠疫菌檢測方面的靈敏度、特異性及抗干擾能力等性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，建立的LAMP反應(yīng)體系在鼠疫菌檢測方面有良好的特異性、抗干擾能力，靈敏度可達(dá)100copy/ml。

10、>　　在磁珠捕獲DNA法結(jié)合LAMP技術(shù)快速檢測鼠疫菌研究中，將LAMP技術(shù)與磁珠捕獲DNA技術(shù)相結(jié)合，依據(jù)磁珠加入量、DNA富集程度對(duì)磁珠捕獲DNA體系進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳體系。并對(duì)該檢測方法的靈敏度、特異性及抗干擾能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)，將該方法與常規(guī)PCR檢測技術(shù)進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法特異性良好，對(duì)鼠疫菌檢測靈敏度可達(dá)10copy/ml，較常規(guī)PCR技術(shù)靈敏度高100倍。在脾臟、肺臟干擾情況下其靈敏性依然可以達(dá)到10copy/ml，

11、比常規(guī)PCR技術(shù)高出1000倍。在肝臟懸液干擾情況下該檢測方法的靈敏度稍有降低至103copy/ml，仍然比常規(guī)PCR技術(shù)高出10倍。
　　在免疫磁珠捕獲菌體法結(jié)合LAMP技術(shù)快速檢測鼠疫菌研究中，首先，基于實(shí)驗(yàn)室已有的鼠疫菌F1單克隆抗體，采用EDC/NHSS化學(xué)偶聯(lián)法將鼠疫菌抗體與磁珠相偶聯(lián)制備免疫磁珠。按實(shí)際捕獲效率、抗體偶聯(lián)率、抗體添加量、檢測中免疫磁珠用量等進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)該檢測方法的靈敏度、特異性、抗干擾能力等方面進(jìn)行

12、了全面評(píng)價(jià)，并將該方法與常規(guī)PCR檢測技術(shù)進(jìn)行對(duì)比。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法可特異地捕獲待檢混合物中的鼠疫菌，靈敏度為1copy/ml，較常規(guī)PCR技術(shù)靈敏度高100倍。在脾臟、肺臟干擾情況下其靈敏性為10copy/ml，其靈敏度比常規(guī)PCR技術(shù)高出1000倍。在肝臟干擾情況下靈敏性為100copy/ml，較常規(guī)PCR技術(shù)高100倍。隨后，采用滅活鼠疫菌為免疫原免疫小鼠，經(jīng)小鼠免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選、細(xì)胞株克隆、腹水制備、抗體純化等

13、步驟制備出不同于F1抗體的鼠疫菌單克隆抗體，并將制備出的單抗應(yīng)用于免疫磁珠捕獲菌體法結(jié)合環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測鼠疫菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，制備出的抗體效價(jià)較高，且在檢測方法上有較好的靈敏度，可應(yīng)用于鼠疫菌的快速檢測。
　　本研究建立了兩種較為成熟的鼠疫菌檢測方法，這兩種檢測方法操作簡便、無需大型儀器、成本低廉，且具有較高的靈敏性、極強(qiáng)的特異性、很強(qiáng)的抗干擾能力，所以，這兩種檢測技術(shù)適合用于現(xiàn)場篩查、野外作業(yè)及偏遠(yuǎn)地區(qū)檢測工作的應(yīng)用。

14、r>　　在現(xiàn)有免疫學(xué)檢測方法中，表達(dá)于鼠疫菌表面的F1抗原已成為唯一的靶標(biāo)物，而鼠疫菌只有以37℃人工培養(yǎng)或哺乳動(dòng)物體內(nèi)為條件才可在表面形成F1抗原，而鼠疫菌最適生長溫度為26℃，且自然環(huán)境中溫度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于37℃，因此，自然環(huán)境下，鼠疫菌表面并不表達(dá)F1抗原。這一現(xiàn)象的存在，對(duì)現(xiàn)有鼠疫菌免疫學(xué)方法的檢測帶來諸多不便。本研究制備出的單克隆抗體對(duì)表面不表達(dá)F1抗原的鼠疫菌有良好的特異性，彌補(bǔ)了現(xiàn)階段免疫學(xué)檢測的漏洞，為鼠疫菌的檢測提供了更廣闊