南林895楊轉小鼠金屬硫蛋白(MT)基因研究.pdf

1、重金屬污染是影響環(huán)境質量和生態(tài)穩(wěn)定的主要問題之一,它不僅影響大氣和水環(huán)境的質量、農作物的生長,而且通過食物鏈嚴重危害動物和人類的健康。由于重金屬污染的廣泛性及其自身不可降解的特點,治理起來十分困難。哺乳動物金屬硫蛋白(Metallo theinoin,MT)是動物體內能專性與重金屬結合的一類低分子量、高巰基含量的蛋白質,本研究以MT基因為目的基因,選擇生物量大、生長迅速的植物(南林895楊)為基因轉移的靶植物,利用植物基因工程技術將目的

2、基因整合到靶植物基因組中,獲得轉MT基因楊樹,用于富集污染土壤中的有害重金屬,從而達到修復生態(tài),從源頭上控制和減少重金屬進入食物鏈,更大范圍內防治動物和人類重金屬中毒發(fā)生的目的。
　　 實驗首先構建了帶有小鼠金屬硫蛋白(MT)基因的植物表達載體pCAMBIA2301-MT,以南林895楊組織培養(yǎng)苗為受體植物,通過農桿菌介導的方法,展開了小鼠金屬硫蛋白基因(MT)的植物遺傳轉化的前期研究,為最終獲得目的基因穩(wěn)定遺傳和高效表達的轉基

3、因楊樹,利用MT結合重金屬的特性富集污染土壤中的重金屬提供基礎。
　　 1、植物表達載體pCAMBIA2301-MT的構建
　　 利用DNA重組技術將包含35S-35S啟動子、AMV、Tnos的MT基因表達框定向克隆至植物中間表達載體pCAMBIA2301中,該載體使用卡那霉素篩選基因,并增加了gus報告基因,新構建的載體可通過根癌農桿菌EHA105導入楊樹基因組,酶切和PCR鑒定表明質粒成功構建。
　　 2、農

4、桿菌轉染后楊樹葉盤脫菌用抗生素種類和濃度的確定
　　 使用四種抗生素(羧芐青霉素(Carbenicillin,Cb)、氨芐青霉素(Ampieillin,Amp)、頭孢霉素(Cefotaxime,Cef)、替卡西林克拉維酸鉀(Timentin,Tim))進行外植體脫菌的抗生素篩選實驗,確定使用濃度為200mg/L的頭孢霉素(Cefotaxime,Cef)時,既不會影響南林895楊葉盤的分化效率,又能夠有效抑制農桿菌的生長。

5、　　 3、真空滲透法轉染農桿菌條件的確定
　　 根據農桿菌轉染葉盤后GUS染色的結果,確定在楊樹葉盤預培養(yǎng)3d,菌液濃度OD6000.5,真空抽吸5min,共培養(yǎng)2d的轉化體系下,楊樹的轉化率最高。經PCR檢測,獲得2株陽性苗。
　　 4、gus報告基因的表達
　　 植物表達載體pCAMBIA2301-MT。在農桿菌的介導下轉染南林895楊后,其上帶有的gus報告基因成功表達,經X-Glue染色、70％乙醇脫色