梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷劉利洪

1、梅毒實(shí)驗(yàn)室診斷,德陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 劉利洪,“性病”概念的演化,性?。菏侵竿ㄟ^性接觸而發(fā)生傳播的一組傳染病。20世紀(jì)70年代以前——經(jīng)典性?。╲enereal diseases,VD） 包括：梅毒、淋病、軟下疳等1975年，WHO——性傳播疾?。╯exually transmitted diseases,STD）20世紀(jì)90年代以后——性傳播感染（sexually transmitted infections,STI）

2、，包括：艾滋病、梅毒、淋病、CA、GH等。,歷史的回顧,性病是一個(gè)歷史悠久的疾病，多數(shù)認(rèn)為梅毒是1505年由印度傳入我國(guó)廣東嶺南。梅毒是一個(gè)曾經(jīng)廣泛流行的性病，解放初期，估計(jì)的性?。ㄖ饕敲范荆┗颊呒s為1000萬。1954年之后，全國(guó)逐漸形成了一個(gè)“四級(jí)”皮膚性病防治體系。1964年，實(shí)現(xiàn)了全國(guó)梅毒基本消滅的目標(biāo)。,性病死灰復(fù)燃,上世紀(jì)70年代末，改革開放后，——性觀念的改變——性產(chǎn)業(yè)的出現(xiàn)——性生活方式的變化高危人群規(guī)模

3、在不斷的增加，如：暗娼、男男性接觸者、流動(dòng)人口等?！圆≡谖覈?guó)死灰復(fù)燃，再度流行。,現(xiàn)況,嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題和社會(huì)問題；臨床認(rèn)知水平不夠，實(shí)驗(yàn)室診斷水平參差不齊；實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)各流程存在不規(guī)范現(xiàn)象；新的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)不斷出現(xiàn)而又缺乏了解；部分（如私人診所）醫(yī)療工作存在過度診療或診療不規(guī)范，延誤患者的最佳診療時(shí)機(jī)；無癥狀感染者成為維系性病流行的重要的傳染源。,,如何就目前高發(fā)的性病，尤其是對(duì)梅毒進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)和控制？如何對(duì)高危人

4、群及潛在易感人群進(jìn)行篩查，主動(dòng)發(fā)現(xiàn)無癥狀的性病感染者？如何確定感染的病原體種類？——需要完善的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作，包括檢測(cè)能力建設(shè)和質(zhì)量控制,,性病防治工作的重點(diǎn) 兩個(gè)系統(tǒng) 疫情監(jiān)測(cè)系統(tǒng) 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)系統(tǒng)-實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力和質(zhì)量控制 一個(gè)服務(wù) 規(guī)范化醫(yī)療服務(wù),,,梅毒的定義,梅毒是由密螺旋體之一的梅毒螺旋體引起的一種慢性全身感染性疾病。是傳統(tǒng)的性傳播疾病之一。,常用梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法,病原學(xué)檢測(cè)血清學(xué)檢測(cè)

5、,病原學(xué)檢查的原理,螺旋體進(jìn)入人體后，在皮下黏膜增殖并沿淋巴管至附近的淋巴結(jié)經(jīng)過2~4周的潛伏在感染部位形成硬下疳。數(shù)天至1周后淋巴結(jié)腫大。再以后經(jīng)血液傳播至全身，或孕婦的羊水中都有大量螺旋體的存在。因此，在梅毒病人的硬下疳、扁平濕疣等皮損以及梅毒病人腫大的淋巴結(jié)，梅毒孕婦的羊水，都可以采集標(biāo)本來做此檢查,梅毒病原學(xué)檢查的應(yīng)用范圍及標(biāo)本采集,適用范圍 病人出現(xiàn)的硬下疳、扁平濕疣、腫大的腹股溝淋巴結(jié)穿刺液、羊水穿刺液等

6、。標(biāo)本采集：略,梅毒病原學(xué)檢查的方法,1、暗視野顯微鏡檢查法2、鍍銀染色檢測(cè)法3、剛果紅負(fù)染色法,暗視野檢查法,儀器器材1、暗視野顯微鏡2、無菌紗布3、不銹鋼刮刀4、滅菌棉拭子5、滅菌生理鹽水6、載玻片、蓋玻片,暗視野檢查法,標(biāo)本收集1、皮膚黏膜組織液2、淋巴液3、羊水,暗視野檢查法,檢測(cè)流程1、制片2、暗視野顯微鏡的使用及觀察,暗視野檢查法,結(jié)果判讀 發(fā)現(xiàn)有纖細(xì)、白色、有折光的螺旋狀微生

7、物，具有旋轉(zhuǎn)、蛇行及伸縮等特征性的運(yùn)動(dòng)方式，可判斷為梅毒螺旋體報(bào)告 暗視野顯微鏡下發(fā)現(xiàn)有上述特征的螺旋體報(bào)告“發(fā)現(xiàn)蒼白螺旋體”,暗視野檢查法,臨床意義1、檢測(cè)陽性，在臨床上可確證梅毒；2、如未能發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體，不能排除診斷；3、無論暗視野顯微鏡檢查的結(jié)果如何，都應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)。,鍍銀染色檢查,檢測(cè)原理 梅毒螺旋體具有親銀性，可被銀溶液染成棕黑色，可以從普通高倍顯微鏡下觀察到梅毒螺旋體

8、。,鍍銀染色檢查,儀器器材1、普通顯微鏡2、加拿大樹膠3、羅吉固定液4、鞣酸媒染劑5、Fontana銀溶液6、無水乙醇7、無菌紗布等取材用品,鍍銀染色檢查,操作流程1、涂片干燥：自然干燥，不可用火固定；2、固定：2-3分鐘3、洗滌：無水乙醇4、媒染：微加熱、30秒5、銀染：水洗、微加熱、30秒6、鏡檢：水洗待干、封片鏡檢,鍍銀染色檢查,結(jié)果判讀 在顯微鏡下觀察到染成棕褐色的螺旋體狀生物，可判斷

9、為梅毒螺旋體。報(bào)告 見到染成棕褐色梅毒螺旋體報(bào)告陽性結(jié)果，否則報(bào)告陰性結(jié)果。,剛果紅負(fù)染色法,原理： 剛果紅是一種酸堿指示劑在涂有標(biāo)本的玻片上剛果紅將玻片染色，而螺旋體、細(xì)菌、細(xì)胞、真菌等生物體形成占位而不著色。再用鹽酸蒸氣將剛果紅的紅色熏成藍(lán)色方便觀察。,剛果紅負(fù)染色法,器材及試劑：1、普通顯微鏡2、1%的剛果紅水溶液、3、濃鹽酸。,剛果紅負(fù)染色法,結(jié)果判讀： 在藍(lán)黑色背景中

10、發(fā)現(xiàn)白色纖細(xì)的螺旋狀微生物螺距數(shù)量為平均6~14個(gè)，可判斷為“蒼白螺旋體”報(bào)告 發(fā)現(xiàn)上述特征螺旋體結(jié)構(gòu)微生物，可報(bào)告“發(fā)現(xiàn)蒼白螺旋體”,,,,,,梅毒血清學(xué)檢測(cè)分類（1）非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)（非特異性梅毒抗體）（2）梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)（特異性梅毒抗體）,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理,梅毒螺旋體一旦感染人體，在3-4周產(chǎn)生抗類脂質(zhì)抗原的IgM和IgG的混合抗體（也叫反應(yīng)素）。未經(jīng)治療的病人，

11、其血清內(nèi)的反應(yīng)素可長(zhǎng)期存在。經(jīng)正規(guī)治療后，反應(yīng)素可以逐漸減少至轉(zhuǎn)陰。,,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理,反應(yīng)素與心磷脂形成抗原抗體反應(yīng)，卵磷脂可加強(qiáng)心磷脂的抗原性，膽固醇可增強(qiáng)抗原的敏感性。心磷脂、卵磷脂及膽固醇都是醇溶性脂類、遇水形成膠體溶液，膽固醇遇水形成結(jié)晶。,,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)原理示意圖,,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)方法,包括：（1）快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR)（2）甲苯胺紅不加熱血清試驗(yàn)（TRUST)

12、（3）性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)（VDRL）所用抗原基本成分是：心磷脂、卵磷脂和膽固醇,,VDRL試驗(yàn)——抗原組成及特點(diǎn)抗原組成：0.03%心磷脂、0.21%卵磷脂、0.90%膽固醇抗原需新鮮配制，不能保存待檢血清需滅活需要在顯微鏡下觀察結(jié)果目前主要用于腦脊液檢查，特異性較高是診斷神經(jīng)梅毒的重要依據(jù)，但檢測(cè)陰性不能排除神經(jīng)梅毒,,,VDRL試驗(yàn)—儀器材料1、水平旋轉(zhuǎn)儀、顯微鏡2、試劑盒：VDRL抗原原液、VDRL緩沖液、抗原

13、滴管及針頭、帶直徑為14mm漆圈的玻璃反應(yīng)板、VDRL試驗(yàn)結(jié)果判讀用參照涂片3、30ml平底玻璃小瓶、生理鹽水,,,VDRL試驗(yàn)—標(biāo)本采集1、血清：新鮮血清或凍存血清；2、腦脊液：采用腰穿術(shù)獲得 一般來說，送檢VDRL試驗(yàn)的腦脊液應(yīng)采集兩份，一份作腦脊液常規(guī)（白細(xì)胞≧10*106/L、蛋白含量＞500mg/L）測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果與另一份用作VDRL試驗(yàn)的腦脊液樣本同時(shí)送實(shí)驗(yàn)室。,,,VDRL試驗(yàn)—操作步驟1、VDRL抗原配

14、制；2、VDRL玻片定性試驗(yàn)（1）滅活：血清標(biāo)本56℃滅活30分鐘；（2）吸樣：吸取0.05ml血清放入反應(yīng)板圈中，并涂布于整個(gè)圈內(nèi)；（3）加抗原：用標(biāo)準(zhǔn)針頭加入1滴抗原；（4）反應(yīng)：置水平旋轉(zhuǎn)儀上旋轉(zhuǎn)4min，180±5次/min，立即置低倍顯微鏡下觀察。,,,VDRL試驗(yàn)—操作步驟3、VDRL定量試驗(yàn)（1）加稀釋液：在圈內(nèi)加入0.05ml生理鹽水；（2）樣本稀釋：吸取0.05ml樣本與第一個(gè)圈內(nèi)生理鹽水混合

15、，混勻后，吸取0.05ml加至第二個(gè)圈，做系列稀釋，并將稀釋樣本涂布于整個(gè)圈內(nèi)（3）同定性試驗(yàn)的（3）、（4）。,,,VDRL試驗(yàn)—結(jié)果判讀凝集反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)：3+——4+：鏡下見中等大小或大的絮狀物，液體清亮；2+ ：絮狀物較小，液體較清亮；1+ ：絮狀物較小，均勻分布，液體渾濁；± ：抗原復(fù)合物顆粒稍粗； ：抗原顆粒均勻、細(xì)小。定性試驗(yàn)：鏡下可見1+——4+的絮狀凝集物

16、為陽性，不產(chǎn)生凝集為陰性；定量試驗(yàn)：鏡下可見絮狀凝集物的樣本最高稀釋倍數(shù)為其滴度。,,,VDRL試驗(yàn)—臨床意義 腦脊液VDRL試驗(yàn)是神經(jīng)梅毒的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)，陽性結(jié)果可診斷為神經(jīng)梅毒，但陰性結(jié)果不能排除診斷，存在假陰性。,,,RPR試驗(yàn)在VDRL試劑成分的基礎(chǔ)上，加入黑色活性碳顆粒，作為凝集的指示物；與待檢血清（漿）中的反應(yīng)素結(jié)合，形成肉眼可見的黑色絮狀物。用白色硬紙片代替玻片；血清不需要滅活；不需要顯微鏡觀察結(jié)果可作

17、定性和定量試驗(yàn),,,TRUST試驗(yàn)原理和成分以及操作與RPR試驗(yàn)相同用紅色的甲苯胺紅替代了活性碳顆粒，在與待檢血清（血漿）中的反應(yīng)素結(jié)合，形成肉眼可見的紅色絮狀物,,,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),樣本類型：血清、血漿、腦脊液樣本保存：短期（1周）內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可存放于2-8℃；保存一周以上的應(yīng)置于-20 ℃以下冰箱保存；長(zhǎng)期保存應(yīng)置于-70 ℃以下冰箱中保存。,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),樣本運(yùn)送：

18、應(yīng)按照生物安全要求進(jìn)行包裝和運(yùn)送。（1）第一層容器（如試管） （2）第二層容器 （3）第三層容器,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),樣本接收：（1）檢查標(biāo)本管有無破損和溢漏；（2）核對(duì)標(biāo)本與送檢單；（3）檢查標(biāo)本的狀況;（4）如標(biāo)本不能接收，怎么處理？（5）樣本交接應(yīng)在接收單上雙方簽字確認(rèn),注意：應(yīng)把每一份樣本當(dāng)作強(qiáng)陽性樣本來處置和對(duì)待！！,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),儀器：水平旋轉(zhuǎn)儀（要求？）試

19、劑盒：（1）含有活性碳的抗原懸液；（2）一個(gè)標(biāo)定的9號(hào)針頭（0.9mm）；（3）壓印有18mm直徑圓圈的封塑環(huán)狀卡片；（4）內(nèi)部對(duì)照； 為了保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，以及每批試劑間的可比性，應(yīng)制備外部對(duì)照血清（5）50ul量程移液器和吸頭（6）0.9%無菌生理鹽水,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),定性試驗(yàn)（1）試劑準(zhǔn)備：復(fù)室溫30分鐘（2）加標(biāo)本：樣本量50ul；（3）加抗原：抗原量（60±1滴/

20、ml，約17ul/滴）（4）反應(yīng)：反應(yīng)時(shí)間8min（5）讀取結(jié)果,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),定量試驗(yàn)抗原1滴 抗原1滴 抗原1滴 抗原1滴 抗原1滴,50ul標(biāo)本1:1（全血）,50ul標(biāo)本50ulN.S1:2,50ulN.S1:4,50ulN.S1:8,50ulN.S1:16,吸取50ul,吸取50ul,吸取50ul,,棄掉50ul,,,,,,,,,,標(biāo)本稀釋順序,

21、,涂布順序,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),結(jié)果判讀判讀凝集反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)：3+ - 4+：圓圈內(nèi)出現(xiàn)中到大的黑色絮狀物，液體清亮；2+ ：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小到中的黑色絮狀物，液體較清亮；1+ ：圓圈內(nèi)出現(xiàn)小的黑色絮狀物，液體渾濁；- ：圓圈內(nèi)僅見碳顆粒集于中央一點(diǎn)或均勻分散。,,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),結(jié)果報(bào)告（1）定性試驗(yàn)： 出現(xiàn)1+-4+強(qiáng)度的凝集反應(yīng)報(bào)告陽性（+）

22、 不產(chǎn)生凝集反應(yīng)報(bào)告陰性（-）（2）定量試驗(yàn)： 出現(xiàn)凝集反應(yīng)的血清最高稀釋倍數(shù)為抗體滴度，結(jié)果報(bào)告滴度為1：X。 也可將每個(gè)稀釋度的反應(yīng)強(qiáng)度依次報(bào)告，如1:1（全血）（4+）、1:2（3+）、1:4（2+）、1:8（1+）、1:16（-）。有利于療效觀察,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),質(zhì)量控制（1）內(nèi)部對(duì)照： 試劑盒含有的陽性質(zhì)控血清，用于檢查該盒試劑的有效性。 新開試劑，以及每天

23、工作開始前或每批試驗(yàn)開始前，應(yīng)常規(guī)進(jìn)行內(nèi)部對(duì)照質(zhì)控。（2）外部對(duì)照： 可采取自留陽性標(biāo)本用作外部對(duì)照。 新開試劑或更換試劑批次，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行外部對(duì)照試驗(yàn)，用于檢查每批試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和可比性。,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),質(zhì)量控制（3）移液器質(zhì)量控制：強(qiáng)檢和定期校準(zhǔn)；（4）旋轉(zhuǎn)儀質(zhì)量控制：檢查轉(zhuǎn)速；（5）人員的質(zhì)量控制：有經(jīng)驗(yàn)人員的指導(dǎo)下開展工作、雙人核對(duì)結(jié)果；（6）操作的質(zhì)量控制：反復(fù)操作、正確操

24、作。,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),臨床意義（1）產(chǎn)生的抗類脂質(zhì)抗體，未經(jīng)治療可長(zhǎng)期存在；（2）經(jīng)適當(dāng)治療后，抗體可以逐漸減少至轉(zhuǎn)為陰性；（3）定性試驗(yàn)結(jié)果可用于現(xiàn)癥梅毒診斷；（4）定量試驗(yàn)結(jié)果可用于療效觀察及判愈。,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),梅毒血清反應(yīng)假陽性 即非梅毒患者的梅毒血清反應(yīng)呈陽性的現(xiàn)象。（1）技術(shù)性假陽性反應(yīng) 由于標(biāo)本保存不當(dāng)（如細(xì)菌污染或溶血）、試劑質(zhì)量差或過期、或試驗(yàn)操作錯(cuò)誤

25、等所造成。（2）生物學(xué)假陽性反應(yīng) 非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)采用的抗原為脂類混合物，所檢測(cè)的抗心磷脂抗體亦可見于其他多種疾病，如自身免疫性疾病、懷孕的婦女，麻風(fēng)病人。,,王千秋教授等檢測(cè)了10546份血清樣本，RPR假陽性率為0.21%（15/7002）。假陽性中： 10例為有高危性行為的常規(guī)檢查者 2例孕婦 皮肌炎、尖銳濕疣、龜頭破潰各1例,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),梅毒血清反

26、應(yīng)假陽性的處理（1）技術(shù)性假陽性反應(yīng)：實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的有效性、重復(fù)操作排除人為操作錯(cuò)誤等；（2）生物學(xué)假陽性反應(yīng)：應(yīng)做TPPA(TPHA)等試驗(yàn)進(jìn)行排除,單一RPR（非特異性抗體血清試驗(yàn)）結(jié)果陽性，不能作為梅毒的確定性診斷試驗(yàn)結(jié)果，需用梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)進(jìn)行確證。,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),前帶現(xiàn)象 指非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)中，有時(shí)血清中存在高濃度的反應(yīng)素導(dǎo)致抗原抗體濃度不匹配，出現(xiàn)弱陽性、不典型或陰性反

27、應(yīng)的結(jié)果，而臨床上又像早期梅毒（一期和二期），此時(shí)將血清稀釋后再進(jìn)行試驗(yàn)，可出現(xiàn)陽性結(jié)果的現(xiàn)象。,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),血清固定 指經(jīng)抗梅毒治療后，非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)在一定時(shí)期內(nèi)不陰轉(zhuǎn)。 早期的血清固定常與治療不足或不規(guī)則治療、復(fù)發(fā)、再感染或有神經(jīng)系統(tǒng)梅毒等因素有關(guān)。 病期不明的潛伏梅毒患者血清固定發(fā)生率顯著增高，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)潛伏梅毒的篩查和及時(shí)治療。,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（

28、RPR),RPR用于腦脊液的檢測(cè)，近年來也有不少研究。 有作者在對(duì)154例各期梅毒患者及90例非梅毒神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的腦脊液進(jìn)行試驗(yàn)并作統(tǒng)計(jì)分析： RPR 腦脊液敏感性為99.1%、特異性為77.8% VDRL 腦脊液敏感性為98.6%、特異性為70.4 結(jié)論：RPR可以代替VDRL用于神經(jīng)梅毒的診斷。 但是？,快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)（RPR),注意事項(xiàng)

29、1、使用無菌生理鹽水；標(biāo)本無嚴(yán)重脂血、溶血和細(xì)菌污染2、正確操作，移液器吸頭保證在血清/血漿液面以下但不能接觸反應(yīng)紙板；防止產(chǎn)生氣泡；3、每批次標(biāo)本數(shù)量不宜過多，防止干燥或血清水分揮發(fā)，4、實(shí)驗(yàn)前應(yīng)檢查水平旋轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)速，常規(guī)進(jìn)行質(zhì)量控制；5、稀釋后攤開液面是順序應(yīng)從低濃度向高濃度進(jìn)行；6、反應(yīng)完畢應(yīng)及時(shí)觀察結(jié)果。,梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn),試驗(yàn)原理： 以梅毒螺旋體特異蛋白為抗原，檢測(cè)梅毒患者血

30、中特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體。 感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗(yàn)呈陽性，則患者幾乎終生陽性。,梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn),試驗(yàn)方法：（1）梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA）（2）梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(yàn)（TPPA）（3）梅毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）（4）梅毒免疫層析法—梅毒快速檢測(cè)（RT）（5）熒光螺旋體抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS）（6）化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA）（7）梅毒螺旋體蛋白印跡試驗(yàn)（

31、WB）,TPPA/TPHA 感染梅毒螺旋體后2-4周內(nèi)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生特異的梅毒螺旋體抗體。TPPA具有較高的敏感性和特異性。 是目前WHO公認(rèn)的梅毒抗原血清學(xué)試驗(yàn)的金標(biāo)準(zhǔn)。,,TPPA試驗(yàn)原理圖,TPPA試驗(yàn)儀器耗材（1）試劑盒 “A”溶解液：用于溶解致敏顆?！癈”和非致敏顆粒“D” “B”血清稀釋液：用于血清標(biāo)本的稀釋 “C”凍干的致敏顆粒 “D”凍干的非致敏顆粒

32、 “E”陽性質(zhì)控血清：為含梅毒抗體的兔血清制品，最終滴度1:320，（2）微量振蕩器（3）移液器及吸頭（4）保濕盒,,TPPA試驗(yàn)檢驗(yàn)流程（1）試劑準(zhǔn)備：試驗(yàn)前復(fù)溫30分鐘（2）加稀釋液（B液）（3）標(biāo)本稀釋（4）加致敏、未致敏顆粒（5）混合：微量振蕩器震蕩30秒（6）反應(yīng)：置濕盒，15-30℃至少2小時(shí)（7）觀察凝集反應(yīng)強(qiáng)度,TPPA試驗(yàn)檢驗(yàn)流程,稀釋液100ul標(biāo)本25ul1:5,稀釋液25ul1:1

33、0,稀釋液25ul1:20,稀釋液25ul1:40,,,,吸取25ul,吸取25ul,吸取25ul,,棄掉25ul,未致敏粒子,致敏粒子,,,℃,TPPA試驗(yàn)結(jié)果判讀 首先觀察未致敏粒子反應(yīng)孔是否出現(xiàn)凝集（第3孔） 如出現(xiàn)凝集，則為無效試驗(yàn)。 如無凝集，則根據(jù)致敏粒子反應(yīng)孔標(biāo)本與致敏粒子是否產(chǎn)生1+-4+凝集反應(yīng)，判斷結(jié)果。,TPPA凝集反應(yīng)分級(jí)4+：粒子光滑覆蓋整個(gè)孔底，有時(shí)邊緣有折疊；3+：粒子光滑覆

34、蓋大部分孔底；2+：粒子光滑聚集覆蓋孔底，周圍有一細(xì)胞環(huán)；1+：粒子光滑聚集覆蓋孔子，周圍有一明顯細(xì)胞環(huán)；±：粒子沉集孔底，中央形成一小點(diǎn)；—：粒子緊密沉積孔底中央。,,,TPPA結(jié)果報(bào)告 未致敏粒子反應(yīng)孔不出現(xiàn)凝集，致敏粒子反應(yīng)孔出現(xiàn)凝集反應(yīng)報(bào)告陽性（+）； 未致敏粒子與致敏粒子反應(yīng)孔均未出現(xiàn)凝集反應(yīng)報(bào)告陰性（-）,TPPA重吸收試驗(yàn) 如標(biāo)本與非致敏和致敏顆粒均產(chǎn)生凝集者，標(biāo)本需作

35、重吸收試驗(yàn)：（1）加0.95ml非致敏顆粒溶液于小試管內(nèi)；（2）加入0.05ml血清充分混勻，置室溫吸收30分鐘以上；（3）2000r/min離心5分鐘，吸取上清液0.05ml加入第3孔；（4）第4孔加血清稀釋液25ul；（5）孔3吸取25ul至孔4，混勻后棄去25ul；（6）分別加致敏與未致敏顆粒（試驗(yàn)方法同上）,TPPA臨床意義1、特異性高（98%），陽性可確證為現(xiàn)癥或既往感染。2、終生陽性，不能作為療效觀察的指標(biāo)。

36、3、不能區(qū)分現(xiàn)癥或既往感染。,梅毒螺旋體抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（TP-ELISA） 是用重組梅毒螺旋體抗原包被固相板條，加上梅毒血清和酶標(biāo)記的單克隆羊抗人免疫球蛋白抗體或酶標(biāo)記的梅毒螺旋體基因重組抗原，形成抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)記物結(jié)合，用酶標(biāo)儀判定陽性反應(yīng)。 可用于大樣本的血清檢測(cè)。,TP-ELISA（雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)） 試驗(yàn)原理：是用重組梅毒螺旋體抗原包被固相板條，加上待檢血清或血漿和酶標(biāo)

37、記的梅毒螺旋體基因重組抗原，形成抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)記物結(jié)合，用酶標(biāo)儀判定陽性反應(yīng)。,TP-ELISA（雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)） 檢測(cè)流程：與其他ELISA檢測(cè)方法相同，按試劑盒說明書進(jìn)行對(duì)照的設(shè)置及檢測(cè)。 結(jié)果判讀及報(bào)告： 1、根據(jù)陽性、陰性對(duì)照的OD值是否在規(guī)定的數(shù)值范圍內(nèi)以判斷試驗(yàn)的有效性，并根據(jù)陽性、陰性O(shè)D值設(shè)定閾值（cut-off); 2、標(biāo)本OD值大于或等于cut-off值報(bào)告

38、陽性，否則報(bào)告陰性。,TP-ELISA（雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)） 臨床意義： 1、同TPPA，可用于非梅毒螺旋體血清試驗(yàn)陽性標(biāo)本的確證試驗(yàn)； 2、可用于大樣本篩查檢測(cè)，但陽性標(biāo)本需進(jìn)一步進(jìn)行非梅毒螺旋體血清試驗(yàn)復(fù)檢，確證是否為梅毒現(xiàn)癥感染者； 3、如對(duì)結(jié)果存在疑問，可用TPPA或其他方法進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)。,關(guān)于TP重組抗原,目前已重組的TP抗原20多種，包括：TP15KD、4D、TP24、G17等。G17的反

39、應(yīng)性比較高，目前的檢測(cè)試劑盒趨向于將2種或2種以上重組抗原聯(lián)合使用，綜合其特性，從而獲得更高的特異性和敏感性。,梅毒螺旋體抗體快速免疫層析檢測(cè)法（TP-RT） 檢測(cè)原理： 以硝酸纖維素膜為載體，將重組的梅毒螺旋體抗原固定在膜上，待檢標(biāo)本與標(biāo)記的梅毒螺旋體特異性抗原結(jié)合并沿著固相載體遷移，陽性結(jié)果在膜上抗原部位形成重組抗原-特異性抗體-標(biāo)記的特異性抗原復(fù)合物，顯示出有色條帶，可直接判讀結(jié)果。,TP-RT檢測(cè)流程：

40、 全血和血清/血漿標(biāo)本檢測(cè)步驟不一樣，但基本流程為： 1、加樣 2、加緩沖液 3、反應(yīng) 4、判讀結(jié)果,,TP-RT臨床意義：1、同TPPA、ELISA?？刹捎萌獧z測(cè)，適合于單樣本快速篩查；2、簡(jiǎn)單、快速，如結(jié)果存在疑問，可用TPPA或其他方法進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。,,TP-RT注意事項(xiàng)：1、如出現(xiàn)無效結(jié)果，應(yīng)再次仔細(xì)閱讀說明書，并用新的試條重新測(cè)試，如問題仍然存在，應(yīng)停止使用該批號(hào)產(chǎn)品；2、注意試劑

41、盒的儲(chǔ)存條件，以及反應(yīng)的溫度條件；3、按試劑盒說明書，反應(yīng)時(shí)間應(yīng)足夠、加樣量也要準(zhǔn)確。,,梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn),梅毒螺旋體熒光抗體吸收試驗(yàn)（FTA-ABS） 檢測(cè)原理： 以梅毒螺旋體作為抗原，與經(jīng)吸收劑吸收的梅毒血清抗體反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，再加入熒光素（FITC）標(biāo)記的抗人免疫球蛋白，形成帶有熒光的抗原抗體復(fù)合物，在熒光顯微鏡下螺旋體顯出綠色熒光。,,FTA-ABS 臨床意義： FTA-ABS是梅毒

42、螺旋體抗原血清試驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其臨床意義同TPPA試驗(yàn)。 腦脊液的FTA-ABS試驗(yàn)陰性可排除神經(jīng)梅毒，但特異性不高，存在假陽性。 操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，需要高質(zhì)量熒光顯微鏡和技術(shù)熟練的操作人員，一般不作為常規(guī)臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。,,梅毒螺旋體抗體化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA) 檢測(cè)原理： 利用雙抗原夾心法化學(xué)發(fā)光免疫分析原理，采用多種梅毒螺旋體特異抗原包被固相發(fā)光微孔板，用辣根過氧化物酶標(biāo)記相同

43、蛋白抗原作為標(biāo)記抗原，與樣本中梅毒螺旋體 抗體形成雙抗原夾心復(fù)合物后，加入化學(xué)發(fā)光底物，測(cè)定其發(fā)光值（RLU），根據(jù)cut-off值判斷結(jié)果,,CLIA儀器耗材 1、化學(xué)發(fā)光免疫分析儀； 2、微孔洗板機(jī)（全自動(dòng)系統(tǒng)無需單獨(dú)配置）； 3、微量振蕩器（全自動(dòng)系統(tǒng)無需單獨(dú)配置）； 4、恒溫箱：37 ±1 ℃ （全自動(dòng)系統(tǒng)無需單獨(dú)配置）； 5、移液器、計(jì)時(shí)器； 6、新鮮制備的蒸餾水或去離子水；,,CLIA 結(jié)

44、果判讀及報(bào)告 根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)量的發(fā)光值（RLU）自動(dòng)判讀結(jié)果。 標(biāo)本RLU值大于或等于cut-off值，報(bào)告陽性； 標(biāo)本RLU值小于cut-off值，報(bào)告陰性。CLIA的臨床意義同TPPA\ELISA 2008年有文獻(xiàn)報(bào)道，以TPPA作為金標(biāo)準(zhǔn)，其 敏感性：94.23% 特異性：98%,梅毒IgM抗體檢測(cè),細(xì)菌、病毒感染后的早期體液免疫應(yīng)答反應(yīng)，結(jié)果是IgM抗體的

45、產(chǎn)生，在梅毒螺旋體的感染中也不例外。 IgM抗體出現(xiàn)在感染的潛伏期、早期梅毒患者及晚期病人。 IgM抗體不能通過胎盤屏障及完整無損的血腦屏障，因此：若在新生兒血中檢測(cè)到TP-IgM抗體是產(chǎn)前感染的診斷依據(jù)；若在完整無損的血腦屏障的腦脊液中出現(xiàn)，則提示患有活動(dòng)性神經(jīng)梅毒。,梅毒IgM抗體檢測(cè),可采用抗IgM單克隆抗體的酶標(biāo)法、蛋白印跡法等進(jìn)行檢測(cè)。 目前測(cè)定IgM抗體的方法的敏感性不高，但檢查到IgM抗體

46、則有助于以下病例的臨床診斷：先天梅毒、早期一期梅毒、晚期梅毒、非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)的抗體陽轉(zhuǎn)前的早期感染病人的判愈試驗(yàn)以及有梅毒史或其他螺旋體感染史病人的再感染。,,龔匡隆教授等就現(xiàn)用梅毒血清試驗(yàn)臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了評(píng)估治療前的敏感度 RPR TPPA TP-IgMELISA一期梅毒（硬下疳） 83.3% 91.7%

47、 91.7%二期梅毒 100% 100% 100%早期潛伏梅毒 88.9% 100% 88.9%正規(guī)治療12月后的敏感度 RPR TP-IgMELISA一期梅毒（硬下疳

48、） - -二期梅毒 64.5% 67.7%早期潛伏梅毒 43.7% 43.7%,先天梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法,依據(jù)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)診斷查到螺旋體；非梅毒螺旋體抗原血清試

49、驗(yàn)滴度持續(xù)上升；滴度高于母親4倍（高于2個(gè)稀釋滴度）；檢測(cè)到抗梅毒的19S-IgM特異性抗體陽性；隨訪18個(gè)月觀察抗體的變化（主要是指特異性抗體）。,神經(jīng)梅毒的實(shí)驗(yàn)室診斷,實(shí)驗(yàn)室診斷標(biāo)準(zhǔn)梅毒螺旋體血清學(xué)檢測(cè)陽性；腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)或蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果異常；腦脊液VDRL試驗(yàn)陽性；腦脊液檢測(cè)到IgM抗體。,檢測(cè)方法評(píng)價(jià),各種檢測(cè)方法在臨床應(yīng)用中都存在一定的局限性。1、梅毒的臨床診斷：（1）特征性皮損中檢測(cè)到梅毒螺旋體；（2）血清

50、中檢測(cè)到抗體。2、梅毒的表現(xiàn)非常復(fù)雜，感染后可不出現(xiàn)皮損或皮損不明顯，檢測(cè)不到抗原；3、感染極早期或窗口期的存在，檢測(cè)不到抗體。,檢測(cè)方法評(píng)價(jià),血清學(xué)檢測(cè)是目前提供診斷依據(jù)的主要的梅毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。1、但檢測(cè)腦脊液中的抗體時(shí)，VDRL更具有臨床診斷價(jià)值。2、對(duì)病人進(jìn)行治療效果的隨訪觀察，需根據(jù)RPR或TRUST定量試驗(yàn)及抗體滴度的變化進(jìn)行判斷。3、抗原血清試驗(yàn)都是檢測(cè)特異性梅毒螺旋體抗體。無論采用哪一種梅毒螺旋體抗原抗體檢測(cè)

51、方法，都不能代替非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)的臨床意義。,,,非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果解釋示意圖,,,,治療前,治療后,,,,,,,,,,,,,,,陽性：,陰性：,一期：,二期：,早期潛伏：,晚期潛伏：,三期：,早期,晚期,梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果解釋示意圖,,,,治療前,治療后,,,,,,,,,,,,陽性：,陰性：,一期：,二期：,早期潛伏：,晚期潛伏：,三期：,早期,晚期,,,,梅毒血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果的臨床意義匯總,應(yīng)用策略,梅毒

52、血清學(xué)檢測(cè)的目的：臨床診療、血液篩查、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、高危人群篩查和干預(yù)等。無論什么目的，都需要根據(jù)非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)和梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)這兩類血清學(xué)檢測(cè)方法的特性進(jìn)行結(jié)果判斷。,應(yīng)用策略,在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)實(shí)際目的選擇任何一類梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法作為篩查；但初篩陽性結(jié)果需經(jīng)另一類梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法復(fù)檢確證，才能夠?yàn)榕R床診斷或疫情報(bào)告等提供依據(jù)。應(yīng)用策略有三種方法。,應(yīng)用策略,采用非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)進(jìn)行篩查,應(yīng)用策略

53、,如果梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，采用的是ELISA、RT等方法，在遇到RPR陽性（+）而ELISA等試驗(yàn)為陰性（-）時(shí)，可采用TPPA方法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證其陰性結(jié)果。,應(yīng)用策略,采用梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)進(jìn)行篩查,應(yīng)用策略,如果梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)，采用的是ELISA、RT等方法，在遇到ELISA陽性（+）而RPA試驗(yàn)為陰性（-）時(shí)，推薦采用TPPA方法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證其陽性結(jié)果。 （試劑比對(duì)中發(fā)現(xiàn)：ELISA敏感性較高、

54、相對(duì)于TPPA方法來說，存在一定的假陽性）,應(yīng)用策略,第三種方法： 將梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)與非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn)同時(shí)開展。 在臨床上對(duì)于RPR等陽性標(biāo)本，由于同時(shí)開展了TPPA等試驗(yàn)，有利于生物學(xué)假陽性的排除，不會(huì)造成治療上的浪費(fèi)和虛假疫情的報(bào)告； 對(duì)于TPPA等試驗(yàn)陽性的標(biāo)本，由于同時(shí)開展了RPR等試驗(yàn)，有利于確證現(xiàn)癥患者，使疫情報(bào)告更加真實(shí)，同時(shí)可對(duì)療效進(jìn)行觀察和隨

55、訪。,應(yīng)用策略,無論使用哪一種策略，出具結(jié)果報(bào)告時(shí)，均需要注明采用的具體方法。 作為臨床醫(yī)生，在取得檢驗(yàn)報(bào)告時(shí)，應(yīng)根據(jù)病人的具體情況，進(jìn)行分析和下診斷結(jié)論。比如：1、患者雖沒有明顯的皮膚表現(xiàn)、但近期有高危性行為、在接到TPPA陽性、RPR陰性結(jié)果時(shí)該怎么解釋？（既往感染已治愈？近期感染早期梅毒？）2、患者否認(rèn)高危性行為，在接到TPPA陰性、RPR陽性結(jié)果時(shí)，怎么解釋？（生物學(xué)假陽性、其他免疫性疾病）,梅毒血清學(xué)檢測(cè)實(shí)