染色1～3min。然后滴加等量蒸餾水

1、實驗一 細胞器的光學顯微鏡觀察,實驗目的,1、觀察人、植物活細胞內(nèi)線粒體和液泡系的形態(tài)、數(shù)量與分布2、學習一些細胞器的超活染色技術,實驗原理,活體染色：能使生活有機體的細胞或組織特異性著色但對活樣品又沒有毒害作用的一種活體染色方法，其目的是顯示生活細胞內(nèi)的某些結構，而不影響細胞的生命活動和產(chǎn)生任何物理、化學變化以致引起細胞的死亡?；铙w染色技術可用來研究生活狀態(tài)下的細胞形態(tài)結構和生理、病理狀態(tài)。 超活染色：體外活體染色又稱超活染色

2、，它是由活的動、植物分離出部分細胞或組織小塊，以染料溶液浸染，染料被選擇固定在活細胞的某種結構上而顯色?；铙w染料之所以能固定、堆積在細胞內(nèi)某些特殊的部分，主要是靠染料的“電化學”特性。堿性染料的膠粒表面帶陽離子，酸性染料的膠粒表面帶有陰離子，而被染的部分本身也是具有陰離子或陽離子，這樣，它們彼此之間就發(fā)生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活體染色，理論上應選擇那些對細胞無毒性或毒性極小的染料，且使用時需要配成稀淡的溶液。一般說來，最為適

3、用的是堿性染料，這可能是因為它具有溶解在類脂質(zhì)(如卵磷脂、膽固醇等)的特性，易于被細胞吸收。詹納斯綠B(Janus green B)和中性紅(neutral red)兩種堿性染料是活體染色劑中最重要的染料，對于線粒體和液泡系的染色分別具有專一性。,生物學實驗中使用的染色劑分為酸性、堿性和中性，染色劑的酸堿性與化學上用H+的離子濃度來定義溶液的酸堿性不同，染色劑的酸堿性與染色劑的顯色基團有關，由主要顯色基團是陽離子或是陰離子來確定，若染色

4、劑的主要顯色基團是陽離子，為堿性染色劑；若染色劑的主要顯色基團為陰離子，為酸性染色劑；若染色劑的顯色基團既有陽離子也有陰離子則稱為中性染色劑（又稱復合染料）。有絲分裂實驗用的醋酸洋紅和龍膽紫溶液的顯色基團均為陽離子，故都是堿性染色劑，亞甲基藍、美藍也是堿性染料；酸性品紅、伊紅是酸性染料，蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ弱酸性染料；對血液進行染色的賴特和吉姆薩是中性染色劑。    在細胞的組成中，原生質(zhì)的堿性部分（如細胞質(zhì)）

5、容易與含陰離子的酸性染料發(fā)生親合力而結合；而原生質(zhì)的酸性部分（如染色質(zhì)）容易與含陽離子的堿性染料發(fā)生親合力而發(fā)生作用。而紅細胞具有特殊的性質(zhì)能與中性染色劑發(fā)生親合力。由此可見細胞成分被染色的強弱與細胞成分的酸堿性以及染料的性質(zhì)有關。,染色劑溶液的酸堿性    染色劑溶液的酸堿性是指染料溶液的pH值，例如醋酸洋紅和龍膽紫溶液均為堿性染料，但它們的溶液卻是酸性，而曙紅為酸性染料但溶液是堿性，又如中性紅是堿性染

6、料而它的溶液呈中性。    染色劑溶液的酸堿性與試劑的成分、反應條件以及染料的溶解度等因素有關。如斐林試劑需要新配制的Cu(OH)2溶液，而雙縮脲試劑需要堿性條件的Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵反應形成紫色或紫紅色的絡合物。又如洋紅的等電點是pH4.07-4.5，此時洋紅的溶解度最小，只有在高于或低于它的等電點的溶液中才易溶解，醋酸洋紅的溶液呈酸性，但它的顯色基團的化學性質(zhì)沒有改變，其中的醋酸分子穿透組織的速度快

7、，并能夠凝固核蛋白，更有利于對染色體的染色。同樣用2%的醋酸配制的1%龍膽紫溶液呈酸性，它對根尖分生區(qū)細胞內(nèi)染色劑的染色效果要好于1%龍膽紫水溶液。    由此可見染色劑的酸堿性不是指染色劑溶液的pH值，而是指染色劑對物質(zhì)進行染色時與顯色有關的主要基團是陽離子還是陰離子,線粒體是細胞內(nèi)一種重要細胞器，是細胞進行呼吸作用的場所。細胞內(nèi)氧化磷酸化和形成ATP的主要場所，細胞的各項活動所需要的能量，主要是通過線

8、粒體呼吸作用來提供的。細胞中線粒體的具體數(shù)目取決于細胞的代謝水平，代謝活動越旺盛，線粒體越多。線粒體可占到細胞質(zhì)體積的25%。一般真核細胞中含成百上千個線粒體，植物因有葉綠體的緣故，線粒體數(shù)目相對較少，單細胞鞭毛藻僅1個，酵母細胞具有一個大型分支的線粒體，巨大變形中達50萬個；許多哺乳動物成熟的紅細胞中無線粒體 。線粒體的形狀多種多樣, 一般呈線狀,也有粒狀或短線狀。線粒體的直徑一般在0.5～1.0 μm， 在長度上變化很大, 一般為1

9、.5～3μm，長的可達10μm ，人的成纖維細胞的線粒體則更長，可達40μm，在胰臟外分泌細胞中可長達10~20μm，稱巨線粒體 。不同組織在不同條件下有時會出現(xiàn)體積異常膨大的線粒體, 稱為巨型線粒體(megamitochondria)。分布在細胞功能旺盛的區(qū)域。詹納斯綠 B是線垃體的專一性活體染色劑。線粒體中細胞色素氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)(即有色狀態(tài))呈藍綠色，而在周圍的細胞質(zhì)中染料被還原，成為無色狀態(tài)。,液泡是細胞內(nèi)濃縮產(chǎn)物的主要

10、場所，有十分重要的功能。液泡的功能主要是調(diào)節(jié)細胞滲透壓，維持細胞內(nèi)水分平衡，積累和貯存養(yǎng)料及多種代謝產(chǎn)物。液泡膜具有特殊的選擇透性，使液泡具有高滲性質(zhì)，引起水分向液泡內(nèi)運動，對調(diào)節(jié)細胞滲透壓、維持膨壓有很大關系，并且能使多種物質(zhì)在液泡內(nèi)貯存和積累。貯存和積累在液泡中的物質(zhì)包括糖、蛋白質(zhì)、磷脂、單寧、有機酸、植物堿、色素和鹽類等。具體情況因植物種類、器官組織部位，成熟程度等的不同而異。液泡是植物細胞質(zhì)中的泡狀結構。幼小的植物細胞（分生組織

11、細胞），具有許多小而分散的液泡，在電子顯微鏡下才能看到。以后隨著細胞的生長，液泡也長大，互相并合，最后在細胞中央形成一個大的中央液泡，它可占據(jù)細胞體積的90％以上。這時，細胞質(zhì)的其余部分，連同細胞核一起，被擠成為緊貼細胞壁的一個薄層。有些細胞成熟時，也可以同時保留幾個較大的液泡，這樣，細胞核就被液泡所分割成的細胞質(zhì)索懸掛于細胞的中央。具有一個大的中央液泡是成熟的植物生活細胞的顯著特征，也是植物細胞與動物細胞在結構上的明顯區(qū)別之一。中性紅

12、為弱堿性染料，對液泡的染色有專一性，只將活細胞中的液泡系染成紅色，細胞核與細胞質(zhì)完全不著色，這可能是與液泡中某些蛋白質(zhì)有關。,線粒體,分生區(qū)：分生區(qū)一般全長約1～2毫米，大部分被根冠包圍著，是產(chǎn)生新細胞的主要地方。屬于分生組織，能使根尖細胞數(shù)目不斷增加。細胞排列緊密，壁薄、核大、質(zhì)稠。伸長區(qū)：位于生長點和根毛區(qū)之間，長度約為幾毫米。伸長區(qū)細胞逐漸伸長，細胞中液泡開始加大，細胞質(zhì)和細胞核逐漸被液泡擠到細胞邊緣。根的生長主要靠生長點細胞

13、分裂（細胞數(shù)目增加）和伸長區(qū)細胞的伸長。由于細胞伸長可以達到原來細胞大小的幾十倍，因此伸長區(qū)的伸長很顯著根毛區(qū)：根毛區(qū)也叫成熟區(qū)。因為此區(qū)的細胞已停止生長，屬于成熟的細胞。在成熟區(qū)最外一層的表皮細胞，它的細胞膜、細胞質(zhì)向外突起逐漸形成根毛。也就是說：根毛是由一個表皮細胞形成的。它的細胞壁極薄，是柔軟而膠粘的，有可塑性，易與土粒緊貼在一起，有效地進行吸收作用。成熟區(qū)是根吸收水分和無機鹽的主要部位。,實驗儀器與材料：,1、 器材: 顯微

14、鏡、恒溫水浴鍋、解剖盤、剪刀、鑷子、雙面刀片、解剖盤．載玻片、凹面載玻片、蓋玻片、表面皿、吸管、牙簽、吸水紙 2、 試劑： Ringer溶液（使細胞保持活性）， 1/3000中性紅溶液（配好后需裝入棕色瓶于暗處保存，否則易氧化沉淀，失去染色能力），1/5000詹納斯綠B 3 、材料： 人體口腔黏膜上皮細胞、洋蔥鱗莖內(nèi)表皮細胞、小麥根尖,實驗步驟：,1、人口腔粘膜上皮細胞線粒體

15、的超活染色與觀察清潔載玻片放在37℃恒溫水浴鍋的金屬板上 ↓ 滴2滴1/5000詹納斯綠B染液 ↓ 用牙簽口腔頰粘膜處稍用力刮取上皮細胞（稍微用牙簽在峽側黏膜上涂刮幾下就行了，不一定要看到把皮給刮下來的，只要牙簽刮了黏膜就會有細胞） ↓ 刮下的粘液狀物放大載玻片的染液滴中 ↓ 染色10~l5min(注意不可使染液干燥，必要時可再加滴染液) ↓ 蓋上蓋玻片,顯微鏡下觀察,2、植物細胞液泡系的超活染色與觀察 取豆芽的

16、根尖 ↓用刀片縱切根尖 放入中性紅染液滴中，染色5~10min。 ↓ 吸去染液，滴一滴Ringer液 ↓ 蓋上蓋玻片進行鏡檢(鑷子輕輕地下壓蓋玻片，使根尖壓扁，利于觀察) 實 驗 結 果 在高倍鏡下，先觀察根尖部分的生長點的細胞，可見細胞質(zhì)中散在很多大小不等的染成玫瑰紅色的圓形小泡，這是初生的幼小液泡。然后，由生長點向延長區(qū)觀察，在一些已分化長大的細胞內(nèi)，液泡的染色較淺，體積增大，數(shù)目變少。在成熟區(qū)細胞中，一般只有一

17、個淡紅色的巨大液泡，占據(jù)細胞的絕大部分，將細胞核擠到細胞一側貼近細胞壁處。,實驗報告,（1）. 繪口腔上皮細胞示線粒體的分布 、洋蔥鱗莖表皮細胞中線粒體的分布圖（2）.根尖液泡的分布圖（3）.何為活體染色和超活體染色,實驗二 細胞骨架的顯示和觀察,實驗目的,掌握植物細胞骨架的光鏡標本制作方法了解植物細胞的細胞骨架基本形態(tài),,,實驗原理,細胞骨架是指細胞質(zhì)中縱橫交錯的纖維網(wǎng)絡結構，按組成成分和形態(tài)結構的不同可分為微管（MT）、微絲（

18、MF）和中間纖維（IF）。廣義的細胞骨架還包括核骨架（nucleoskeleton）、核纖層（nuclear lamina）和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix），形成貫穿于細胞核、細胞質(zhì)、細胞外的一體化網(wǎng)絡結構。它們對細胞形態(tài)的維持、細胞的生長、運動、分裂、分化和物質(zhì)運輸?shù)绕鹬匾饔谩９鈱W顯微鏡下細胞骨架的形態(tài)學觀察多用1% （曲拉通100）Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）處理細胞，可使細胞膜溶解，使

19、95%以上的可溶性蛋白質(zhì)以及全部脂質(zhì)被抽提，而細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)被保存， 再用考馬斯亮蘭R250染色，使得胞質(zhì)中細胞骨架得以清晰顯現(xiàn)。,微絲功能,維持細胞形態(tài)，賦予質(zhì)膜機械強度細胞運動：成纖維細胞爬行與微絲裝配和解聚相關微絨毛(microvillus)： 是腸上皮細胞的指狀突起，用以增加腸上皮細胞表面積，以利于營養(yǎng)的快速吸收。應力纖維(stress fiber)：在形成粘合斑的質(zhì)膜下，微絲緊密平行排列成束，形成應力纖維,

20、具有收縮功能。參與胞質(zhì)分裂：收縮環(huán)由大量反向平行排列的微絲組成，其收縮機制是肌動蛋白和肌球蛋白相對滑動。肌肉收縮(muscle contraction),,微管的功能,維持細胞形態(tài)用秋水仙素處理細胞破壞微管,導致細胞變圓,說明微管對維持細胞的不對稱形狀是重要的。對于細胞突起部分,如纖毛、鞭毛、軸突的形成和維持, 微管亦起關鍵作用。細胞內(nèi)物質(zhì)的運輸細胞器的定位鞭毛(flagella)運動和纖毛(cilia)運動纖毛與鞭毛的

21、結構纖毛運動機制紡錘體與染色體運動,中間纖維的功能,增強細胞抗機械壓力的能力 角蛋白纖維參與橋粒的形成和維持 結蛋白纖維是肌肉Z盤的重要結構組分，對于維持肌肉細胞的收縮裝置起重要作用參與傳遞細胞內(nèi)機械的或分子的信息中間纖維與mRNA的運輸有關,,實驗步驟（第一種方法）,第二種方法,取洋蔥的外表皮2 張, 大小約為0 .5 cm×0 .5 cm, 放到培養(yǎng)皿中 用0 .01 mol / L 磷酸鹽緩沖生理鹽水

22、( PBS) 浸泡取得的洋蔥外表皮3 次, 每次3min; 再加1% Triton X-100/ M- 緩沖液處理洋蔥外表皮約30min; 再用M- 緩沖液浸泡3 次, 每次5 min ; 加甲醇- 冰醋酸混合細胞固定液（甲醇- 冰醋酸混合液3∶1 ）固定細胞, 固定15 ～30 min; 用0 .01 mol / L 磷酸鹽緩沖生理鹽水( PBS) 清洗細胞3 次, 每次3 min ; 用鑷子將洋蔥外表皮細胞取出放到載玻片上

23、, 鋪平后用濾紙把水吸干;滴加0 .2% 考馬斯亮藍R250 染液染色30 min; 用水沖洗細胞,等到自然干燥后即可觀察。,注:a . 染色15 min ;b . 染色60 min 。Note :a . Staining for 15 min ; b . Staining for 60 min .圖1 0.2%考馬斯亮藍R250 染液染色后洋蔥表皮細胞(40 ×16)Fig .1 Onionepidermal c

24、ell after staining with0.2% Coomassie brilliant blue R250dyeing solution(40 ×16)而染色30 和60 min 的照片圖像所觀察到的效果明顯比染色15 min 的好, 但染色60 min 的效果更佳, 圖像十分清晰。結果表明, 染色時間一般至少要超過30 min, 染色60 min 的效果比較好。,實驗三 細胞形態(tài)結構的觀察,實驗目的,1、掌握光鏡

25、下細胞基本形態(tài)結構2、初步掌握臨時制片的方法3、學習生物繪圖的方法4、 認識血涂片中紅細胞及各類白細胞的形態(tài)構造特點.5、 進一步掌握光學顯微鏡的使用方法,1、細胞生物學實驗繪圖方法與要求,一、在仔細觀察的基礎上，選擇典型結構進行描繪，要求真實、準確(注意各部結構的比例關系)。二、用鉛筆繪圖，線條要明確清晰，圖的深淺明暗一律以點的疏密來表示，點要圓而一致，不得涂暗影或進行其它美術加工。 三、各部結構名稱要在一側引直線注明。各

26、引線要平行不得交叉。四、每幅圖的大小、位置在紙面上必須安排得當并注意紙面的整潔。,2、各種細胞形態(tài),上皮細胞（人口腔上皮、小腸切片） 單層扁平上皮：人口腔上皮細胞，細胞輪廓呈多邊形或不規(guī)則的波浪形，每個細胞內(nèi)有一個圓形核；骨骼?。M切和縱切） 骨骼肌由骨骼肌纖維構成。骨骼肌纖維是長圓柱狀細胞，每一條肌纖維內(nèi)有大量圓形細胞核（可多達上百個）。其細胞質(zhì)又稱肌漿，含有豐富的肌原纖維、線粒體和脂肪滴等。肌原纖維呈細絲狀，沿細胞長軸平行排

27、列。每條肌原纖維都具有明暗相間的帶。神經(jīng)元細胞 神經(jīng)細胞由兩部分組成，即細胞主體和突起。用于感受刺激與傳導沖動。 不論細胞的形狀如何，細胞的結構一般分為三大部分：細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核。但也有例外。例如：哺乳類紅細胞成熟時細胞核消失。,平滑肌細胞,神經(jīng)細胞,哺乳動物的紅細胞呈扁圓形、體積很小，是一種非常特化的細胞。哺乳動物的紅細胞無核，亦無其它重要細胞器，主要是由細胞膜包著血紅蛋白。這些特點與紅細胞交換氧與二氧化碳的功能密切相關。

28、細胞體積小、呈圓形，非常有利于在血管內(nèi)快速運行，體積小則相對表面積大，有利于提高氣體交換效率。細胞內(nèi)主要是血紅蛋白，有助于結合更多的氧與二氧化碳。因此，紅細胞的形態(tài)和結構裝置與其交換氣體的功能的關系是非常合理的。精子在細胞后端具有能運動的鞭毛，前端具有有助于進入卵的頂體,紅細胞模式圖，凹圓盤形，無核,3、實驗原理,1、細胞體積雖然差別很大，但大多數(shù)都必須借助顯微鏡觀察；2、細胞內(nèi)含水較多，不染色不易觀察，故需用生物染料染色。,4、各

29、種細胞一般形態(tài)結構的觀察,1、洋蔥鱗莖表皮細胞的標本制備與觀察（1）標本制作（2）觀察：2、人口腔黏膜上皮細胞標本的制備與觀察（1）標本制作（2）觀察：3、血涂片的制作與血細胞的觀察（1）采血與涂片（2）染色（3）觀察4、立體細胞的觀察（1）標本制作（2）觀察,采血前用70％酒精棉球消毒人的指腹,采血,由于第一滴血中含單核白細胞較多，因此棄去第一滴血。,推片：擠出第二滴血置于載玻片的右側,再取另一張邊緣光滑的雙凹

30、片，斜置于血滴的前緣，先向后稍移動輕輕觸及血滴，使血液沿玻片端展開成線狀。,,,,30~45°,兩玻片的角度以30~45°為宜，輕輕將雙凹片向前勻速推進，即涂成血液薄膜。,染色,待涂片在空氣中完全干燥后，滴加數(shù)滴Wright’s染液蓋滿血膜為止，染色1～3 min。然后滴加等量蒸餾水，使其與染液均勻混合，靜置10～15 min。用蒸餾水沖去染液，吸水紙吸干，鏡檢。,,結果顯示,淋巴細胞,單核細胞,嗜中性粒細胞,嗜酸性