光動(dòng)力學(xué)療法影響變形鏈球菌生長(zhǎng)和形態(tài)的體外研究

1、<p>　　光動(dòng)力學(xué)療法影響變形鏈球菌生長(zhǎng)和形態(tài)的體外研究</p><p>　　許小輝1，蔣 琳1，林居紅1，劉明方2（401147重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院兒童牙病中心與口腔預(yù)防科1；400016重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心2）</p><p>　　[摘要] 目的 研究甲苯胺藍(lán)為光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)變形鏈球菌體外生長(zhǎng)及表面形態(tài)的影響，探討光動(dòng)力學(xué)療法影響致齲菌生長(zhǎng)

2、代謝的作用機(jī)制。方法 在不同光劑量和不同光敏劑濃度下，通過體外活菌菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)變形鏈球菌的生長(zhǎng)抑制作用，掃描電鏡觀察光動(dòng)力學(xué)療法處理前后菌體表面形態(tài)的改變，實(shí)驗(yàn)分空白對(duì)照組、光敏劑對(duì)照組、光對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，各組間活菌菌落取對(duì)數(shù)值后采用析因設(shè)計(jì)方差分析。結(jié)果 光動(dòng)力學(xué)療法能顯著抑制變形鏈球菌的體外生長(zhǎng)，隨著光照時(shí)間和光敏劑濃度的增加，其滅菌效果逐漸增強(qiáng)。當(dāng)光敏劑濃度為100 μg/ml，光照時(shí)間為5、15、25 min時(shí)，

3、細(xì)菌菌落對(duì)數(shù)值分別為7.40±0.13、6.86±0.14、6.44±0.28，與空白對(duì)照組（8.30±0.04）相比差異有顯著性（P<0.01），5 min與15 min兩實(shí)驗(yàn)組之間差異有顯著性（P<0.01）。光敏劑濃度和光劑量二因素之間存在交互作用（F=19.47, P<0.01）。掃描電鏡觀察結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組變形鏈球菌與對(duì)照組相比菌體表面粗糙不平，有水泡狀凸起。結(jié)論 甲苯胺

4、藍(lán)為光敏劑介導(dǎo)的光動(dòng)力學(xué)療法能顯著抑制變形鏈球菌體外生長(zhǎng)</p><p>　　[關(guān)鍵詞] 光動(dòng)力學(xué)療法；變形鏈球菌；齲病</p><p>　　[中圖法分類號(hào)] R780.1 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A</p><p>　　In vitro study of Photodynamic Therapy on the Viability and Morphology of

5、 Streptococcus mutans</p><p>　　Xu Xiaohui 1, Lin Juhong1, Liu Mingfang2, Jiang Lin (1Children’s dental center, the Affiliated Stomatology Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing,401147; 2Teaching

6、 center of Chongqing Medical University, Chongqing,400015, China)</p><p>　　[Abstract] Objective To evaluate the impact of photodynamic therapy on the viability and morphology of Streptococcus mutans in a pla

7、nktonic culture. Methods Inhibitory action of toluidine blue O-mediated photodynamic therapy on Streptococcus mutans were analyzed by colony-counting method under different light intensity in vitro conditions;Cell morpho

8、logic changes of streptococcus mutans was observed under scanning electron microscope. Samples were prepared and divided into control group , photos</p><p>　　[Key words] Photodynamic therapy; Streptococcus m

9、utans; Dental caries</p><p>　　Supported by the project of Chongqing Bureau of Public Health（2008-2-243). Corresponding author:Lin Juhong, Tel:（023）89035821-8301, E-mail : juhonglin@sina.com</p><p&

10、gt;　　光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamic therapy，PDT)是一種聯(lián)合利用光、光敏劑和氧分子產(chǎn)生光化學(xué)效應(yīng)選擇性殺傷病原微生物的新方法[1]，當(dāng)感染部位局限時(shí)，其治療效果更具優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)，PDT逐漸應(yīng)用于口腔醫(yī)學(xué)。作為繼癌癥、心血管疾病之后的第三大慢性非傳染性疾病，齲病形成和發(fā)展的主要因素是細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物。目前國(guó)外已有學(xué)者研究不同光敏劑介導(dǎo)的PDT對(duì)主要致齲菌的影響，以探索其應(yīng)用于控制菌斑和預(yù)防齲病的可能性[2]；國(guó)內(nèi)關(guān)

11、于PDT在齲病防治領(lǐng)域的研究報(bào)道甚少。變形鏈球菌是公認(rèn)的主要致齲菌之一，其在口腔中存在的數(shù)量及比例，可以作為齲患風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的一個(gè)重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)研究在不同光劑量和不同光敏劑濃度下PDT對(duì)變形鏈球菌的生長(zhǎng)抑制作用，并用掃描電鏡觀察處理前后變形鏈球菌菌體形態(tài)的改變，初步探討PDT影響致齲細(xì)菌生長(zhǎng)代謝的機(jī)制，為其作為一種預(yù)防齲病的新方法應(yīng)用于臨床提供初步理論依據(jù)。</p><p><b>　　1材料

12、與方法</b></p><p>　　1.1 實(shí)驗(yàn)菌株與培養(yǎng)基</p><p>　　變形鏈球菌 Streptococcus mutans ATCC25175。實(shí)驗(yàn)菌株由四川大學(xué)口腔生物醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。培養(yǎng)基：BHI培養(yǎng)基，由友康基業(yè)生物科技（北京）有限公司提供。</p><p><b>　　1.2光敏劑和光源</b>&l

13、t;/p><p>　　光敏劑：甲苯胺藍(lán)（toluidine blue O,TBO）粉劑（Sigma, St. Louis, MO,USA），用生理鹽水分別配制成濃度為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml的溶液，0.22μm微孔濾器過濾除菌，4℃下避光保存，備用。光源：歐美娜窄譜紅光光動(dòng)力治療儀(Photo Therapeutics Ltd，UK)，由重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。具體參數(shù)如下：波長(zhǎng)（63

14、3±3）nm，輸出功率（40±5）W,功率密度為100mW/cm2，光源類型為L(zhǎng)ED二極管非相干光。</p><p><b>　　1.3 實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　1.3.1 實(shí)驗(yàn)菌液的制備 將變形鏈球菌ATCC25175凍干菌種復(fù)蘇，接種于BHI血瓊脂培養(yǎng)基，37℃下厭氧（80% N2，10%H2，10% CO2）培養(yǎng)48 h，

15、經(jīng)生化鑒定及形態(tài)學(xué)檢查為純培養(yǎng)物后，接種于BHI液體培養(yǎng)基增菌18 h，麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濃度為1.0McFarland（3.0×108 CFU/ml），稀釋100倍后備用。</p><p>　　1.3.2 PDT的處理過程和實(shí)驗(yàn)分組 取標(biāo)準(zhǔn)96孔板(Coming Incorporated)1個(gè)，每孔分別滴加100 μl甲苯胺藍(lán)溶液和100 μl菌液，使甲苯胺藍(lán)最終濃度為25、50、100 μg/

16、ml，菌液濃度為1.5×106 CFU/ml?？瞻讓?duì)照組分別滴加100 μl BHI培養(yǎng)基和100 μl菌液。在渦旋振蕩器上混勻后，黑暗中放置5 min，然后按產(chǎn)品說明書用LED光源在距離96板3 cm處照射，照射時(shí)間分別為5、15、25 min，相應(yīng)的照射劑量為31.5、94.5、157.5 J/cm2。為了避免光照時(shí)間的相互干擾，在處理組照射時(shí)，其他各組均用錫箔紙遮蓋以隔絕光源。</p><p>　

17、　1.3.3 菌落計(jì)數(shù) PDT處理后，將96孔板置于渦旋振蕩器上震蕩1 min以充分混勻菌液，取100 μl菌液稀釋于900 μl 0.01 mol/L無(wú)菌PBS緩沖液（pH=7.0）中，吹打均勻后再取100 μl菌液稀釋于900 μl PBS緩沖液中，如此反復(fù)做10倍遞增連續(xù)稀釋，使各管中的菌液稀釋度分別為102～105 CFU/ml，取103 ～105 CFU/ml稀釋液各20 μl滴注于BHI瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃下厭氧（

18、80% N2、10%H2、10% CO2）培養(yǎng)24～48 h，選擇最合適的濃度段進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。取每組3個(gè)平行樣，取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。</p><p>　　1.3.4 掃描電鏡觀察 在無(wú)菌試管中放入大小為0.8 cm×0.8 cm無(wú)菌蓋玻片，加入5 ml BHI液體培養(yǎng)基，接種菌液100 μl,37℃兼性厭氧條件下（80% N2，10%H2，10% CO2）培養(yǎng)24 h后，涂片檢查以確保樣本無(wú)污染

19、。小心棄去菌液，取出蓋玻片，無(wú)菌PBS緩沖液輕柔漂洗2遍以去除疏松附著的游離菌，實(shí)驗(yàn)組蓋玻片表面滴加25 μl濃度為100 μg/ml的甲苯胺藍(lán)，黑暗中放置5 min后光照15 min，相應(yīng)的能量密度為94.5 J/cm2。對(duì)照組蓋玻片不做處理，僅用無(wú)菌PBS緩沖液輕柔漂洗2遍，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蓋玻片立即放入2.5%戊二醛溶液中，4℃下過夜，然后依次用30%、50%、70%、90%、100%乙醇梯度脫水，干燥、噴金，掃描電鏡下觀察細(xì)菌形

20、態(tài)。</p><p><b>　　1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析</b></p><p>　　用SAS9.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，各組間進(jìn)行析因設(shè)計(jì)方差分析。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)變形鏈球菌體外生長(zhǎng)的抑制作用</p><p>

21、;　　PDT對(duì)變形鏈球菌的生長(zhǎng)抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1、2。單獨(dú)的光和甲苯胺藍(lán)對(duì)變形鏈球菌生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。二者同時(shí)作用產(chǎn)生的光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)顯著抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)。PDT實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比有顯著性差異（P<0.05）。隨著光照時(shí)間和光敏劑濃度的增加，其滅菌效果逐漸增強(qiáng)。當(dāng)光敏劑濃度≤50 μg/ml時(shí)，同一濃度段不同光照時(shí)間段各組間無(wú)顯著性差異（P﹥0.05）。當(dāng)光敏劑濃度為100

22、 μg/ml時(shí)，光照時(shí)間5min與15min兩實(shí)驗(yàn)組間有顯著性差異（F=7.91，P<0.01）, 15min與25min兩實(shí)驗(yàn)組間無(wú)顯著性差異（F=2.67，P﹥0.05）；光敏劑濃度和光照時(shí)間二因素之間存在交互作用（F=19.47，P<0.01）。</p><p>　　表1 不同濃度甲苯胺藍(lán)和不同光照時(shí)間下光動(dòng)力作用前后Sm菌落數(shù)對(duì)數(shù)值(n=3，±s）</p><p&

23、gt;　　a:P<0.05 ,與空白對(duì)照組(TB=0,光照時(shí)間=0)比較；b:P<0.01 ,與實(shí)驗(yàn)組(TB=100,光照時(shí)間=5)比較</p><p>　　表2 甲苯胺藍(lán)濃度和光照時(shí)間析因設(shè)計(jì)分析結(jié)果</p><p>　　2.2 光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)變形鏈球菌形態(tài)的影響</p><p>　　掃描電鏡圖片結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組變形鏈球菌形態(tài)與對(duì)照組相比有明顯變化。在

24、20 000倍掃描電鏡圖下，對(duì)照組變形鏈球菌菌體外形清晰，菌細(xì)胞表面光滑連續(xù)、無(wú)缺損（圖1A），實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌雖然菌體外形清晰，但大部分菌細(xì)胞表面粗糙不平，有水泡狀凸起，菌細(xì)胞周圍有散在的不定形物質(zhì)溢出（圖1B）。</p><p>　　↑：右下角為箭頭對(duì)應(yīng)處細(xì)菌放大圖。</p><p>　　A:對(duì)照組;B：實(shí)驗(yàn)組</p><p>　　圖2 掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組變形鏈球菌形

25、態(tài)（×20 000）</p><p><b>　　3討論</b></p><p>　　PDT的主要原理涉及光敏劑、光源和氧分子[3]。光敏劑在適宜光的激發(fā)下由基態(tài)變成激發(fā)態(tài)并與與周圍的氧分子結(jié)合，釋放出單線態(tài)氧等多種活性氧物質(zhì)。這些活性氧物質(zhì)可以與微生物體內(nèi)的重要生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，造成生物大分子活性物質(zhì)喪失，導(dǎo)致微生物死亡[4,

26、5]。與傳統(tǒng)抗菌療法相比，PDT不僅對(duì)各種革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都有顯著的抑制作用，而且不會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性[6,7]。與單純的激光治療相比， PDT屬于冷光治療，更為安全可靠。此外，光敏劑與細(xì)菌結(jié)合的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于與哺乳動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的結(jié)合能力，因此PDT表現(xiàn)出對(duì)組織表面或組織內(nèi)細(xì)菌的選擇性殺傷作用，而對(duì)正常組織細(xì)胞影響較小[8]；當(dāng)感染部位局限時(shí)治療效果更具優(yōu)勢(shì)。而口腔疾病大多數(shù)是由于細(xì)菌引起的慢性局限性感染，PDT由于其治療優(yōu)勢(shì)，在口腔醫(yī)

27、學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景被國(guó)內(nèi)外學(xué)者看好。國(guó)外已有學(xué)者[9]證實(shí)波長(zhǎng)為632.8nm的He-Ne激光與甲苯胺藍(lán)結(jié)合產(chǎn)生的光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)能夠破壞變形鏈球菌生物膜的穩(wěn)定性，提出甲苯胺藍(lán)和He-Ne激光結(jié)合產(chǎn)生的光動(dòng)力學(xué)效應(yīng)可以用于治療牙菌斑感染性疾病。然而國(guó)內(nèi)類似研究卻鮮有報(bào)道。</p><p>　　細(xì)菌是影響齲病形成和發(fā)展的主要因素，它們以菌斑生物膜的形式在牙表面聚集，通過生長(zhǎng)代謝活動(dòng)，改變局部微環(huán)境條件，造成牙體硬組織損傷

28、。變形鏈球菌血清型c、e、f仍然是公認(rèn)的與齲病密切相關(guān)的主要致病菌，其在口腔中存在的數(shù)量以及與其他細(xì)菌的比例，可以作為齲患風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的一個(gè)重要指標(biāo)[10]。因此本實(shí)驗(yàn)選取變形鏈球菌為研究對(duì)象。</p><p>　　Zanin等[11]用甲苯胺藍(lán)與發(fā)光二級(jí)管激發(fā)光（波長(zhǎng)為630nm）結(jié)合作用于遠(yuǎn)緣鏈球菌和變形鏈球菌3-7天的生物膜，發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲苯胺藍(lán)濃度為0.1mg/ml，激發(fā)光能量密度為85.7 J /cm2時(shí)，產(chǎn)生的

29、光敏作用能夠減少生物膜內(nèi)95%以上的細(xì)菌數(shù)量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：甲苯胺藍(lán)為光敏劑介導(dǎo)的PDT可以顯著抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)，隨著光照劑量和甲苯胺藍(lán)濃度的增加其滅菌效果逐漸增強(qiáng)；當(dāng)光敏劑濃度為100 μg/ml，光照時(shí)間為15min時(shí)，PDT的效果達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)。這個(gè)結(jié)果與Zanin的結(jié)論非常接近，而Araujo PV[12]用甲基藍(lán)作為光敏劑觀察其被紅色激光激發(fā)后產(chǎn)生的光動(dòng)力效應(yīng)對(duì)變形鏈球菌的影響，在光敏劑濃度為25 mg/L時(shí)取得了最佳的抗

30、菌作用（滅菌率為75%）; Metcalf[13]用波長(zhǎng)550nm白色激光激發(fā)光敏劑赤蘚紅作用于變形鏈球菌，發(fā)現(xiàn)5×1min的間斷照射效果優(yōu)于5min連續(xù)光照,推測(cè)原因是連續(xù)光照時(shí)光敏劑可能還未完全與細(xì)菌結(jié)合時(shí)便被光活化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與國(guó)外相似實(shí)驗(yàn)的差異性說明PDT的成功療效依賴于適宜的光敏劑類型、劑量和照射光源類型、光劑量等具體治療參數(shù)的精確優(yōu)化。此外，</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選擇的光敏劑甲苯胺藍(lán)是

31、第二代光敏劑，與第一代光敏劑相比，能迅速與細(xì)菌結(jié)合并穿透細(xì)胞膜進(jìn)入菌細(xì)胞內(nèi)部，對(duì)病變區(qū)域、細(xì)菌有較好的選擇性[14,15]；在組織中有較好的穿透深度；與波長(zhǎng)為630nm左右的光結(jié)合能產(chǎn)生單態(tài)氧，在殺滅致病菌的同時(shí)對(duì)正常組織細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用[16]；Soukos[17]報(bào)道甲苯胺藍(lán)吸收適宜波長(zhǎng)的紅色激光后多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，即使當(dāng)致敏底物，如脫礦牙本質(zhì)、膠原酶存在的情況下，仍然具有抗菌作用，并且產(chǎn)生光敏作用的過程中對(duì)人角化上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)

32、胞不會(huì)產(chǎn)生毒性作用。此外，其價(jià)格較低，便于推廣普及。</p><p>　　本實(shí)驗(yàn)掃描電鏡圖片結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組變形鏈球菌形態(tài)與對(duì)照組相比有明顯變化。對(duì)照組變形鏈球菌菌體外形清晰，菌細(xì)胞表面光滑連續(xù)、無(wú)缺損；實(shí)驗(yàn)組變形鏈球菌雖然菌體外形清晰，但大部分菌細(xì)胞表面粗糙不平，有水泡狀凸起，菌細(xì)胞周圍有散在的不定形物質(zhì)溢出，說明細(xì)胞壁和細(xì)胞膜接觸結(jié)構(gòu)被破壞，由于胞內(nèi)物質(zhì)的喪失而導(dǎo)致細(xì)菌包膜和體積的減少。</p>

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