甜茶甙對變形鏈球菌作用的體外實驗研究.pdf

1、目的：
　　 通過體外研究甜茶提取物——甜茶甙對口腔致齲菌變形鏈球菌的生長、粘附以及代謝的影響，探討含有天然甜味劑的植物——廣西甜茶對變形鏈球菌抑制的作用機制，為今后開發(fā)利用甜茶甙提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、甜茶甙溶液和菌液制備采用二倍稀釋法，用TTY培養(yǎng)基將甜茶甙配制成40g/100ml至0.125g/100ml的溶液。
　　 將S.mutans于TSB培養(yǎng)基活化3h后，接種于MSB固體培養(yǎng)

2、基37℃下厭氧培養(yǎng)48小時，挑取典型菌落于5ml無菌生理鹽水內(nèi)制成混懸液，調(diào)光密度值(OpticalDensity，OD)為1.0的菌懸液，用細菌計數(shù)板計算細菌的濃度。
　　 2、甜茶甙對變形鏈球菌生長的影響采用試管稀釋法測定甜茶甙對S.mutans生長的最低抑菌濃度(Minimalinhibitoryconcentration，MIC)大小，并離心收集各試管細菌，置于2ml生理鹽水中，混勻，紫外可見光分光光度計測OD540nm

3、值。
　　 3、甜茶甙溶液對S.mutans產(chǎn)酸作用的影響根據(jù)甜茶甙對變鏈菌MIC測定結(jié)果，選取MIC值以下5個濃度，用含1％蔗糖的TTY液體培養(yǎng)基稀釋，接種等量的變鏈菌懸液，37℃下厭氧培養(yǎng)48小時，并求出培養(yǎng)前后的△pH值，并與同濃度的木糖醇的△pH值對比。
　　 4、甜茶甙溶液對S.mutans粘附作用的影響取MIC以下的5個濃度，用含1％蔗糖的TTY液體培養(yǎng)基進行甜茶甙溶液的對倍稀釋，按甜茶甙溶液與菌液10∶1比

4、例接種，所有試管30°水平角厭氧培養(yǎng)48h后，將粘附到試管壁的細菌用NaOH溶液洗脫，測定OD540，并計算粘附抑制率，與同濃度的木糖醇的粘附抑制率對比。
　　 5、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Glucosyl trans ferase，GTF)的提取和水不溶性胞外多糖(Insoluble exopolysaccharides)的檢測取MIC以下的5個濃度，用TTY液體培養(yǎng)基配制不同濃度的甜茶甙溶液各3ml，加入S.mutans菌液0.3m

5、l，厭氧培養(yǎng)后將細菌培養(yǎng)物離心，收集上清液，加入固體硫酸銨，離心后，將沉淀溶于磷酸鹽緩沖液中透析，獲得GTF粗酶。采用考馬斯亮藍法(Bradford法)測定液總蛋白含量，采用Smogyi法測定酶一底物反應(yīng)液中還原糖量。GTF活力單位(IU)定義為標準條件下(37℃反應(yīng)1h每分鐘從蔗糖釋放1μmol還原糖所需的酶量)，并計算酶的比活力。
　　 在沉淀物(菌體)中加入0.5mol/L的NaOH5ml離心，并于上清液加入3倍體積的無水

6、乙醇，離心，沉淀即為反應(yīng)生成的水不溶性胞外多糖，用蒽酮法測定水不溶性胞外多糖的含量。與同濃度的木糖醇中S.mutans的酶活性和不溶性胞外多糖對比。
　　 結(jié)果：
　　 1、在試管稀釋法實驗中，甜茶甙濃度在20g/100ml以上的培養(yǎng)基內(nèi)無變鏈菌生長，濃度在10g/100ml以下的培養(yǎng)基內(nèi)均有變鏈菌生長，且隨著甜茶甙濃度的降低，溶液中變鏈菌的濃度增加。根據(jù)實驗結(jié)果判定其MlC值是20g/100ml；且在甜茶甙濃度高于或等

7、于0.313g/100ml時，甜茶甙組S.mutans的OD值總體均數(shù)低于陰性對照組(P＜0.01)，即當(dāng)n≥0.313時對變鏈菌的生長有抑制性，且其抑制性隨甜茶甙濃度升高而增加。
　　 2、產(chǎn)酸實驗后各濃度組pH值均較實驗前下降，而木糖醇組的產(chǎn)酸較多使其pH值下降較明顯。各甜茶甙組間實驗前后△pH(pH變化量)總體均數(shù)間均具有差異(P＜0.05)，在甜茶甙濃度為1.25g/100ml時，S.mutans的△pH值變化量是最小的

8、；甜茶甙組△pH值的總體均數(shù)間顯著低于木糖醇組與陰性對照組△pH(P＜0.001)。
　　 3、隨著甜茶甙濃度的升高，粘附抑制率也隨之增高。各濃度甜茶甙組粘附菌液的OD值的總體均數(shù)顯著低于木糖醇組與陰性對照組(F=98.02，p＜0.01)；甜茶甙濃度組除5g/100ml、2.5g/100ml、1.25g/100ml外，其余各組間均具有顯著性差異(p＜0.001)。
　　 4、甜茶甙溶液中S.mutans酶液中總蛋白、G

9、TF酶活力、水不溶性胞外多糖的結(jié)果4.1隨著甜茶甙濃度的升高，S.mutans酶液中總蛋白的含量也在增加。不同濃度甜茶甙組總蛋白含量高于木糖醇組和陰性對照組(P＜0.01)；而陰性對照組則高于木糖醇組(P＜0.01)；甜茶甙各濃度組除了0.625g/100ml、0.313g/100ml，其余各組間總蛋白含量的總體均數(shù)均具有顯著性差異(p＜0.001)。
　　 4.2隨著甜茶甙溶液濃度的逐漸升高，S.mutans的GTF活性逐漸降

10、低。陰性對照組的還原糖量、酶活力、比活力均高于甜茶甙組、木糖醇組(p＜0.05)；不同濃度木糖醇組的酶活力顯著高于甜茶甙組(p＜0.001)；甜茶甙組除了5g/100ml、2.5g/100ml、1.25g/100ml，其余各組間還原糖量、酶活力、比活力的總體均數(shù)均具有顯著性差異(p＜0.001)。
　　 4.3隨著甜茶甙溶液濃度的逐漸升高，S.mutans生成的水不溶性胞外多糖含量呈下降趨勢；陰性對照組變鏈菌合成水不溶性胞外多糖

11、的能力顯著高于甜茶甙和木糖醇組(p＜0.001)；甜茶甙濃度組除了5g/100ml、2.5g/100ml、1.25g/100ml外，其余各組間具有顯著性差異(p＜0.001)。
　　 經(jīng)Pearson相關(guān)檢驗，甜茶甙組和木糖醇組的GTF酶活性與IS含量之間均呈正相關(guān)關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1、甜茶甙對S.mutans的生長具有明顯的抑制作用。
　　 2、甜茶甙可以抑制S.mutans產(chǎn)酸，并顯著抑制S