1α，25-(OH)-,2-D-,3-介導(dǎo)成骨細(xì)胞影響破骨細(xì)胞形成及活化的研究.pdf

1、本文研究了不同濃度1α，25-(OH)2D3對(duì)體外培養(yǎng)OB增殖、分化及RANKL、OPG蛋白和mRNA表達(dá)的影響，并觀察了RANKL對(duì)體外培養(yǎng)OC形成及骨吸收活性的影響，旨在闡明維生素D調(diào)節(jié)骨代謝的部分機(jī)制。 1.1α,25-(OH)2D3對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞增殖、分化及周期的影響 2.5 g/L胰酶和1 g/L II型膠原酶兩步消化法分離3-4日齡SD大鼠乳鼠顱蓋骨細(xì)胞。采用倒置顯微鏡、掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，堿性磷酸酶(

2、ALP)特異染色鑒定OB。在此基礎(chǔ)上，向培養(yǎng)體系中添加不同濃度的1α,25-(OH)2D3(0[無(wú)水乙醇溶劑對(duì)照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)。作用24、48、72 h，MTT法測(cè)定OB增殖率、PNPP法測(cè)定ALP活性，流式細(xì)胞儀測(cè)定OB周期。結(jié)果顯示，10-9 mol/L1α,25-(OH)2D3作用24、48、72 h均促進(jìn)OB增殖(P<0.05或P<0.01)，抑制ALP活性(P<0.01)；10-8、10-7 m

3、ol/L作用24、48 h，OB增殖率與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，但24 h時(shí)ALP活性均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，48 h則抑制了ALP活性并使OB滯留在G2/M期(P<0.05或P<0.01)；72 h時(shí)10-7 mol/L組OB增殖率極顯著低于其余各組(P<0.01)，并又使ALP活性升高(P<0.01)。說(shuō)明，低濃度1α，25-(OH)2D3(10-9 mol/L)促進(jìn)OB增殖，抑制其分化；中高濃度1α，2

4、5-(OH)2D3(10-8、10-7 mol/L)抑制OB增殖，促進(jìn)其分化，并使細(xì)胞滯留在G2/M期。 2.1α，25-(OH)2D3對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞骨架、GJIC及[Ca2+]i的影響 在OB培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，不同濃度的1α，25-(OH)2D3(0[無(wú)水乙醇溶劑對(duì)照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)作用20 min、24 h，流式細(xì)胞儀測(cè)定[Ca2+]i；24、48 h，熒光顯微鏡觀察F-actin及細(xì)胞

5、間隙連接通訊(GJIC)。結(jié)果顯示，20 min時(shí)，不同濃度1α，25-(OH)2D3組[Ca2+]i均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；24 h時(shí)10-9 mol/L組[Ca2+]i則顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其余各組間差異不顯著(P>0.05)，此時(shí)10-8、10-7 mol/L組大部分細(xì)胞變得扁平，F(xiàn)-actin排列較對(duì)照組有序，形成應(yīng)力纖維；48 h時(shí)，對(duì)照組及10-9 mol/L組F-actin表達(dá)減少，10-9 mol/

6、L組GJIC極顯著弱于對(duì)照組(P<0.01)，而10-8、10-7 mol/L組大部分細(xì)胞F-actin表達(dá)完好，GJIC均極顯著強(qiáng)于其余兩組(P<0.01)。說(shuō)明，1a，25-(OH)2D3能夠影響鈣離子通道，同時(shí)低濃度1α，25-(OH)2D3(10-9 mol/L)抑制F-actin表達(dá)及細(xì)胞間隙連接通訊，中高濃度1α，25-(OH)2D3(10-8、10-7 mol/L)則能維持OB形態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞間隙連接通訊。 3.1α

7、，25-(OH)2D3對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞超微形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響 在OB體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，不同濃度1α，25-(OH)2D3(0[無(wú)水乙醇溶劑對(duì)照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)處理48 h，掃描電鏡、透射電鏡觀察OB超微形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果，與對(duì)照組比較，10-9 mol/L1α，25-(OH)2D3組細(xì)胞鋪展較好，表面針狀突起、胞內(nèi)線粒體增多；10-8 mol/L1α，25-(OH)2D3組細(xì)胞趨于扁平，表面突起減少，變得

8、細(xì)長(zhǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多；10-7 mol/L1α，25-(OH)2D3組細(xì)胞外基質(zhì)中大量絲狀纖維連接成網(wǎng)狀，細(xì)胞內(nèi)線粒體較少，出現(xiàn)大量空泡及鈣顆粒沉積。說(shuō)明，低濃度1α，25-(OH)2D3(10-9 mol/L)能促進(jìn)OB增殖，而中高濃度1α，25-(OH)2D3(10-8、10-7 mol/L)抑制OB增殖，促進(jìn)細(xì)胞外膠原形成及基質(zhì)礦化。 4.1α，25-(OH)2D3對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞RANKL及OPG表達(dá)的影響 在OB

9、體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，不同濃度1α，25-(OH)2D3(0[無(wú)水乙醇溶劑對(duì)照]、10-9、10-8、10-7 mol/L)作用24、48、72 h，分別采用ELISA及FQ-PCR法測(cè)定RANKL、OPG蛋白及mRNA含量。結(jié)果，10-8、10-7 mol/L1α，25-(OH)2D3較對(duì)照組、10-9 mol/L組顯著或極顯著促進(jìn)RANKL蛋白及mRNA的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)；10-9、10-8 mol/L1α，25-(O

10、H)2D3在不同時(shí)間，較對(duì)照組顯著或極顯著促進(jìn)OPG蛋白及mRNA的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，而10-7 mol/L則極顯著抑制OPG mRNA表達(dá)(P<0.01)；最終，10-9 mol/L組48 h時(shí)RANKL/OPG比值增高(P<0.05),10-8、10-7 mol/L1α,25-(OH)2D3組RANKL mRNA/OPG mRNA及RANKL/OPG比值則始終高于對(duì)照組和10-9 mol/L組(P<0.01)。說(shuō)明

11、，1α，25-(OH)2D3可劑量依賴性地上調(diào)RANKL mRNA/OPG mRNA及RANKL/OPG比值，促進(jìn)OC的生成及骨吸收功能，增強(qiáng)骨更新。 5.RANKL對(duì)體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞形成和活化的影響 分離5-6周齡ICR小鼠長(zhǎng)骨骨髓細(xì)胞，分兩階段培養(yǎng)。第一階段分三組(A、對(duì)照組[不添加任何因子]；B、50 ng/mL RANKL；C、25 ng/mL M-CSF)培養(yǎng)3d，進(jìn)入第二階段(I、對(duì)照組[不添加任何因子]；I

12、I、25 ng/mL M-CSF；III、25 ng/mLM-CSF+50 ng/mL sRANKL)繼續(xù)培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，酸性磷酸酶(ACP)染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及掃描電鏡觀察骨吸收陷窩，鑒定OC的生成及骨吸收活性，同時(shí)熒光顯微鏡觀察F-actin。結(jié)果，第一階段培養(yǎng)3d，對(duì)照組和50 ng/mL RANKL組細(xì)胞均無(wú)貼壁及增殖能力，而25 ng/mLM-CSF明顯促進(jìn)細(xì)胞貼壁與增殖。第二階段培養(yǎng)2d，

13、25 ng/mL M-CSF+50 ng/mLRANKL組較25 ng/mL M-CSF組出現(xiàn)更多單核巨細(xì)胞，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)單核巨細(xì)胞增多，出現(xiàn)2個(gè)核以上的巨細(xì)胞，且M-CSF存在的各組細(xì)胞均可表達(dá)ACP活性；培養(yǎng)9d，25 ng/mL M-CSF+50 ng/mL sRANKL組出現(xiàn)3個(gè)核的TRAP陽(yáng)性O(shè)C(10.17±1.55個(gè)/孔)，OC數(shù)極顯著高于對(duì)照組(0個(gè)/孔)和25 ng/mL M-CSF組(0.67±0.69個(gè)/孔)(P