黑楊三倍體速生性狀形成的分子機制研究.pdf

1、楊樹是重要的經(jīng)濟、生態(tài)樹種，也是我國防護林的主要栽培樹種。在育種工作中發(fā)現(xiàn)，多個天然加倍的三倍體楊樹，其性狀優(yōu)良，生長速率、抗性和材質等指標都超越二倍體，但由于林木的遺傳背景復雜，目前對三倍體速生性狀形成的分子機理研究較少。本研究以黑楊二倍體和三倍體為材料，利用MSAP技術、基因芯片、小RNA測序等手段，從基因表達水平、DNA甲基化水平和miRNA表達水平綜合分析黑楊三倍體速生性狀形成的相關分子機理。主要結果如下:
　　1.MSA

2、P分析，發(fā)現(xiàn)黑楊三倍體不同發(fā)育時期（頂芽，幼葉及成熟葉片）的甲基化動態(tài)變化與二倍體顯著不同，三倍體CHG甲基化從3.23％升高到5.83％，CG甲基化從21.31％降到14.41％，后升高到19.28％。其中CHG甲基化三倍體顯著高于二倍體。分別參與CG甲基化的MET1和CHG甲基化的CMT，及建立甲基化的DRM在二倍體和三倍體間表達量差異顯著，并且在三倍體葉片發(fā)育不同時期，MTase的表達量變化與其相應控制DNA甲基化模式變化基本吻合

3、。21條甲基化差異片段測序發(fā)現(xiàn)18條甲基化差異片段位于基因編碼區(qū)。而且頂芽，幼葉的DNA甲基化水平與表達下調基因數(shù)間存在顯著相關性，這說明DNA甲基化參與了黑楊三倍體化后的基因表達調控，CG和CHG甲基化可能參與不同的調控機制，CG甲基化參與維持基因組的穩(wěn)定，CHG甲基化參與特定基因的表達調控。
　　2.利用楊樹基因芯片分析黑楊三倍體和二倍體的葉片基因表達差異，共分析到表現(xiàn)上調的轉錄本1564個，表現(xiàn)下調的轉錄本2015個，GO分

4、類分析發(fā)現(xiàn)151個上調基因分類，94個下調基因分類。上調基因主要參與生長素、油菜素內酯合成代謝，碳氮循環(huán)代謝和細胞壁合成代謝。下調基因主要與核酸代謝有關。初步表明黑楊三倍體基因表達受倍性變化的影響，其速生性狀形成與基因表達變化有關。
　　3.利用NimbleGene楊樹12×135K基因表達譜芯片，首次全面分析黑楊三倍體、二倍體的頂端分生組織，幼葉，木質莖和木質根的基因表達變化，48276個基因中共檢測到約2.1萬個基因成表達狀態(tài)

5、，各組織表達基因數(shù)接近，但發(fā)現(xiàn)部分基因的空間表達位置發(fā)生變化。在各組織中檢測到數(shù)量不等的差異表達基因，莖中差異基因最多，上調基因2307個，下調基因2155個，并且其中特異性在莖中升高和降低的基因為1125個和768個。
　　4.芯片結果GO分類分析顯示，黑楊三倍體頂芽中生長發(fā)育相關基因表達上調，生長素、細胞壁合成旺盛;幼葉生長素動態(tài)平衡、細胞壁合成基因表達同樣旺盛;莖中富集了大量生物量調控基因，細胞壁各組分合成、修飾、加厚、沉積

6、等相關過程的基因也表達上調;根中發(fā)現(xiàn)根發(fā)育相關基因表達上調。組織間差異表達基因分析發(fā)現(xiàn)，頂芽、幼葉生長素相關基因表達活躍，頂芽、幼葉、莖中細胞壁合成相關代謝活躍，葉片、莖、根中PCD過程和防御反應基因活躍。這些分析顯示了黑楊三倍體速生優(yōu)勢形成的基因表達基礎，尤其是莖中大規(guī)模的轉錄調控因子相關基因的表達變化可能與莖的快速生長有關。
　　5.黑楊三倍體莖中檢測到促進莖伸長的，BRs信號通路轉錄因子BES1表達量升高，及其相關信號通路上

7、游受體和相關激酶表達上調，表明黑楊三倍體莖快速發(fā)育主要與BRs信號通路的激活有關，同時黑楊多個組織發(fā)育的PCD過程也與BRs有關，因此，推測黑楊三倍體各組織的基因表達變化主要與生長素和BRs信號通路的激活有關。
　　6.利用Solexa測序技術，首次分析了黑楊三倍體和二倍體的小RNA的特征，發(fā)現(xiàn)小RNA、已知植物miRNA前體聚類結果和楊樹已知miRNA前體結果，黑楊三倍體均顯著多于二倍體，其中參與甲基化指導的24 nt的sRNA

8、豐度最高。與已知miRbase比對，黑楊中共發(fā)現(xiàn)773條miRNA與已知miRNA前體有聚類結果。表明，黑楊三倍體受基因組變化的影響產(chǎn)生了大量的sRNA，其中包括siRNA和miRNA，siRNA的大量激活可能與黑楊三倍體的DNA甲基化水平的變化有關，而miRNA的表達量變化則參與基因的表達調控。
　　7.分析了29個楊樹已知miRNA，在黑楊二倍體和三倍體的葉片和莖發(fā)育的5個時期的表達量變化，發(fā)現(xiàn)三倍體葉片發(fā)育前期大部分miRN

9、A的表達量低于同期二倍體，而后期表達量升高;莖中幾乎所有miRNA在各個發(fā)育時期表達量均高于同期二倍體，這可能是黑楊莖中大規(guī)模轉錄因子表達變化的促發(fā)因素。在黑楊三倍體和二倍體中預測了8個新miRNA，通過前體克隆表達分析等手段最終確定4個黑楊新miRNA，預測了miRNA的靶基因，首次在楊樹中發(fā)現(xiàn)pec-miR3x-2的靶基因為控制sRNA合成的RNA聚合酶Ⅳ的亞基，其表達量的變化與miRNA成反比。分析表明，miRNA確實在黑楊三倍體

10、的發(fā)育中呈現(xiàn)不同于二倍體的變化規(guī)律，推測這些miRNA的差異表達直接影響了生長素和BRs等相關信號通路基因的表達。
　　8.在黑楊葉片的芯片分析中分離克隆了7個高表達基因和調控相關基因，構建了pRI101-PtSIP3,pRI101-PtISPS,pRI101-PtAIM1,pBI121-PtGDSL,pBI121-PtClpC1，pRI101-Pt674共6個表達載體，除Pt674未獲得轉基因擬南芥，其余5個楊樹基因均轉入擬南芥

11、，目前為止，Ptsip3的轉基因擬南芥中觀察到顯著表型變化，過表達Ptsip3在擬南芥中抑制胚和果莢發(fā)育、促進根的快速生長。推測該基因在黑楊三倍體中的表達升高，可能會參與黑楊三倍體的營養(yǎng)生長期的調控并促進根的發(fā)育。
　　結合前期對黑楊二倍體和三倍體的基因組結構、DNA甲基化分析，不同組織的基因表達分析、sRNA測序和miRNA表達分析的結果，認為黑楊三倍體基因組結構沒有發(fā)生大規(guī)模的改變，而黑楊速生性狀形成的直接原因是生長素、BRs