三種楊樹再生體系的建立及三倍體銀中楊轉YUCCA1基因的研究.pdf

1、楊樹是楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)植物的統(tǒng)稱，具有早期速生、適應性強、分布廣、種類和品種多、容易雜交、容易改良遺傳性、容易無性繁殖等特點，廣泛用于生態(tài)防護林、三北防護林、農林防護林和工業(yè)用材林，同時也是道路綠化、園林景觀的優(yōu)秀樹種。而且，楊樹作為速生樹種之一，世界范圍內栽培廣泛，遺傳資源豐富，無性再生能力強，生長迅速，輪伐周期相對較短，被普遍認為是未來生物能源的重要物種之一。但是依靠常規(guī)育種方法，育種周期長，工序

2、復雜，且受氣候、地域和水分等的影響，選育新品種難度大，難以滿足有目的定向培育楊樹新品種的需要。自80年代以后，現(xiàn)代分子生物學技術，尤其是基因工程技術的發(fā)展給楊樹育種帶來了前所未有的變革，極大地提高了育種效率和擴展了育種目標。至今為止，楊樹轉基因育種工作已開展二十多年，雖然轉基因技術已日漸成熟，但仍存在缺乏轉化受體系統(tǒng)及轉化率低等問題。因此，建立高效穩(wěn)定的楊樹離體再生體系和遺傳轉化體系，可為進一步進行轉基因育種和基因功能快速驗證提供技術平

3、臺，具有重要的科學意義。
　　 本研究以三倍體銀中楊(Triploid Populus alba×P.berolinensis)、中林46楊(P.deltoides Cl.‘Zhonglin46’)、西豐楊25號(P.deltoldes Bartr.×P.cathayana Rehd.Cl.'Xifeng-25')三個楊樹品種為試驗材料，通過對不同培養(yǎng)階段最佳培養(yǎng)基的篩選，建立了其穩(wěn)定高效的再生體系，并在此基礎上，以三倍體銀中楊

4、試管苗葉片為受體材料，利用根癌農桿菌介導法轉化YUCCA1基因，對影響三倍體銀中楊轉化效率的主要因素進行了研究，研究結果如下：
　　 1、三種楊樹高效再生體系的建立：以三倍體銀中楊、中林46楊和西豐楊25號帶芽莖段為外植體，通過一系列試驗，建立了三種楊樹的高效再生系統(tǒng)，篩選出三種楊樹不同階段最佳培養(yǎng)基與激素濃度分別為：
　　 (1)三倍體銀中楊：①初代培養(yǎng)：1/2MS+TDZ0.02 mg·L-1(單位下同)+NAA0.

5、05，10 d后腋芽萌發(fā)，30 d后腋芽萌發(fā)率可達96％，芽平均長度為6.0 cm；②繼代培養(yǎng)：MS+BA0.05+NAA0.02，30 d后分化率可達100％，莖高為3.5 cm，60 d后莖高達7.0 cm；③生根培養(yǎng)：1/2MS+NAA0.05+IBA0.20，20 d后生根率可達100％。
　　 (2)中林46楊：①初代培養(yǎng)：1/2MS+BA7.5+NAA0.05+TDZ0.02，10 d后腋芽萌發(fā)，30 d后腋芽的萌發(fā)

6、率為88％，芽平均長度為4.0 cm；②繼代增殖培養(yǎng)：MS+BA0.5+NAA0.05+IBA0.1，30 d后分化率可達92％，平均不定芽數(shù)10.2個；③壯苗培養(yǎng)：MS+BA0.1+IBA0.3，30 d后莖高3.5 cm，壯苗率為90％；④生根培養(yǎng)：1/2MS+NAA0.01+IBA0.3，20 d后生根率可達93％;
　　 (3)西豐楊25號：①初代培養(yǎng)：1/2MS+TDZ0.02+NAA0.05，10 d后腋芽萌發(fā)，30

7、 d后腋芽的萌發(fā)率為94％，芽平均長度為5.0 cm；②繼代增殖培養(yǎng)：MS+TDZ0.02+NAA0.05，30 d后分化率可達96％，平均不定芽數(shù)12.1個；③壯苗培養(yǎng)：MS+BA0.02+NAA0.02，30 d后莖高5.0 cm，壯苗率為92％；④生根培養(yǎng)：1/2MS+NAA0.02+IBA0.3，20 d后生根率為90％。
　　 上述培養(yǎng)基均添加25 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂，pH值為5.8，培養(yǎng)溫度(25±2

8、)℃，光照度2000 lx，光照時間12-14 h·d-1。
　　 2、三倍體銀中楊遺傳轉化受體系統(tǒng)的建立：以三倍體銀中楊試管苗葉片為外植體，建立了葉片不定芽再生體系，并在此基礎上，確定了不定芽再生和生根的卡那霉素(Km)選擇壓及抑菌抗生素濃度。結果表明，三倍體銀中楊最佳葉片不定芽再生培養(yǎng)基為1/2MS+BA0.6+NAA0.1+25 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂，不定芽再生率達99.4％，每葉平均生芽數(shù)約10.1個；葉片

9、不定芽再生和生根的Km選擇壓均為50 mg·L-1；mg·L-1，且不會影響葉片不定芽的再生及生根。
　　 3、三倍體銀中楊遺傳轉化條件的優(yōu)化：以銀中楊試管苗葉片為受體材料，研究了預培養(yǎng)時間、侵染菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間、共培養(yǎng)基中添加乙酰丁香酮濃度、選擇方式6個因素對三倍體銀中楊遺傳轉化效率的影響。結果顯示三倍體銀中楊最優(yōu)轉化條件為：葉片預培養(yǎng)2 d，OD600nm=0.6的菌液侵染20 min，共培養(yǎng)4 d，共培養(yǎng)基中

10、添加乙酰丁香酮50μmol·L-1，共培養(yǎng)后延遲14 d選擇。經過不定芽再生選擇培養(yǎng)和不定芽生根選擇培養(yǎng)，共獲得62株Km抗性植株。
　　 4、Km抗性植株的PCR檢測：將獲得的62株Km抗性植株進行PCR檢測，結果顯示有16株呈陽性反應，初步證明YUCCA1基因已被導入到三倍體銀中楊基因組中。
　　 綜上所述，本研究以三倍體銀中楊、中林46楊和西豐楊25號為試驗材料，在建立其穩(wěn)定高效再生體系的基礎上，采用根癌農桿菌介導