百合AG類(lèi)基因的同源克隆和分析.pdf

1、百合花姿優(yōu)美，是世界鮮切花市場(chǎng)的五大主要產(chǎn)品之一。但在營(yíng)銷(xiāo)和消費(fèi)過(guò)程中，花粉污染衣物和其他一些有價(jià)值的物品一直是一個(gè)缺憾。因此，通過(guò)調(diào)控百合花發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，調(diào)控形態(tài)發(fā)生，改變百合的花器官的結(jié)構(gòu)是近年花卉育種學(xué)家探索的重要領(lǐng)域。本研究基于這一基本目標(biāo)，進(jìn)行了百合花器官發(fā)育基因調(diào)控有關(guān)的基礎(chǔ)研究，并對(duì)分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn)。主要結(jié)論如下： 從植物組織中提取RNA是進(jìn)行植物分子生物學(xué)方面研究的重要前提。百合的植物組織中富

2、含多糖，多糖的許多理化性質(zhì)與RNA很相似，因此很難將它們分開(kāi)。在去除多糖的同時(shí)RNA也被裹攜去除，造成RNA產(chǎn)量的減少，這就使得提取百合的RNA比較困難。本試驗(yàn)采用了五種方法(CTAB法、TRIZOL法、WI法、GT法和TRIS-SDS法)，對(duì)三個(gè)百合種試驗(yàn)材料(鮮切花、卷丹、麝香百合)進(jìn)行了研究。鮮切花為市售東方百合產(chǎn)品，購(gòu)回后用液氮冷萃后，-70℃保存?zhèn)溆谩＞淼ず枉晗惆俸蠟閷?shí)驗(yàn)室種質(zhì)資源圃中收集的材料，開(kāi)花時(shí)直接從植株上采下，于液氮

3、冷萃后，-70℃保存?zhèn)溆谩?試驗(yàn)結(jié)果顯示，CTAB、TRIZOL和WI法均不適合百合RNA的提取，TRIZOL法雖然操作簡(jiǎn)單，步驟少，但是得到的RNA不純；CTAB法用于提取鮮切花根本提取不到RNA，用于提取卷丹和麝香百合時(shí)，也出現(xiàn)不同程度的降解；GT法雖然適合百合的提取，但是操作復(fù)雜，而且得到的RNA含量不高，效率很低。TRIS-SDS法既能提取到高質(zhì)量的RNA，也能高效提取，并對(duì)不同品種的百合有普遍的通用性。經(jīng)過(guò)改進(jìn)的TRI

4、S-SDS法，操作也比較簡(jiǎn)便，試驗(yàn)中一些試劑都可以自己配制，降低了試驗(yàn)費(fèi)用。 參照單子葉植物的AG類(lèi)基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用RT-PCR的方法，從百合中擴(kuò)增AG到同源片段，并根據(jù)擴(kuò)增出的片段序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行5'RACE和3'RACE的擴(kuò)增，最終獲得全長(zhǎng)。本試驗(yàn)從百合中克隆得到了2個(gè)近全長(zhǎng)的花發(fā)育相關(guān)基因片段LLAGM1，2，它們都屬于MADSbox基因家族，并和AG類(lèi)基因有較高的同源性。 LLAGM1全長(zhǎng)1000b

5、p，編碼243個(gè)氨基酸。LLAGM1的氨基酸序列與擬南芥AG的同源性為68.5％，與榛子CaMADS1的同源性為68.5％，與風(fēng)信子HAG的同源性為73％，與百合LLAG1同源性為92.2％，與水稻OsMADS3的同源性為68.2％，與姬蝴蝶蘭PeMADS1的同源性為71％，與矮牽牛pMADS3的同源性為68.8％。氨基酸序列比較可以看出，LLAGM1和LLAG1的M區(qū)完全相同，但是在K區(qū)存在18個(gè)不同的氨基酸序列，在C端有兩個(gè)不同的氨

6、基酸。 LLAGM2全長(zhǎng)1168bp，編碼249個(gè)氨基酸。LLAGM2與多種植物的AG類(lèi)基因同源性較高。LLAGM1的氨基酸序列與擬南芥AG的同源性為64.1％，與榛子CaMADS1的同源性為64.6％，與風(fēng)信子HAG的同源性為68.6％，與百合LLAG1同源性為86.5％，與水稻0sMADS3的同源性為63.6％，與姬蝴蝶蘭PeMADS1的同源性為68％，與矮牽牛pMADS3的同源性為65.3％。LLAGM2與LLAG1在K區(qū)