巨型艾美球蟲NT株gam82基因表達載體的構(gòu)建及其免疫保護性試驗.pdf

1、本研究對巨型艾美球蟲南通株(E.maxima Nantong strain)配子體gam82基因進行了克隆、序列分析、原核表達和核酸疫苗的構(gòu)建，并對重組蛋白與核酸疫苗在雞體內(nèi)的免疫保護作用進行了初步的試驗，為在臨床上利用重組疫苗控制雞球蟲病奠定基礎。 1、E.maxima NT株gam82基因的克隆與序列分析 以E.maxima NT株純化的配子體提取的總RNA為模板，設計特異性引物，應用RT-PCR技術擴增出gam82

2、基因的特異性片段。將擴增片段插入pGEM-TEasy載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)藍白斑篩選、酶切鑒定為陽性的克隆進行測序驗證。結(jié)果顯示，克隆的基因全長為1791個核苷酸，具有一個完整的開放閱讀框，編碼596個氨基酸，其序列與E.maxima Houghton株的完全一致。用Predicting Antigenic Peptides預測軟件分析gam82基因編碼區(qū)的抗原性，顯示存在19個抗原決定簇，其中酪氨酸富集區(qū)所在的第28

3、2～503位氨基酸具有抗原位點達8個之多(在本研究中命名為gam82-Y區(qū))。 2、E.maxima NT株gam82基因的原核表達 根據(jù)E.maxima NT株gam82抗原基因Y區(qū)的cDNA序列設計1對引物，經(jīng)PCR從陽性質(zhì)粒模板中擴增出目的片段。該基因片段經(jīng)酶切回收后按正確的閱讀框架克隆入大腸桿菌表達載體pGEX-6P-1谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因的下游，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX-6P-1-gam82-Y，并經(jīng)測序驗

4、證。重組菌經(jīng)過IPTG誘導后，通過SDS-PAGE電泳和Western-blot檢測，gam82-Y基因片段在大腸桿菌中得到了融合表達，分子量約為53 Ku?？扇苄苑治霰砻鳎诤系鞍字饕园w形式存在。以E.maxima高免血清為一抗進行Western-blot檢測，顯示重組抗原gam82-Y具有免疫原性。 3、E.maxima NT株gam82基因核酸疫苗的構(gòu)建 以已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEM-T-gam82為模板，用含

5、有EcoRI和Hind III酶切位點的1對特異性引物擴增出gam82基因的ORF片段。將擴增片段插入pcDNA3.1載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，經(jīng)Amp抗性篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒后用EcoRI和Hind III雙酶切鑒定，并測序驗證重組質(zhì)粒中am82基因閱讀框架的正確性。采用MTT法與ELISA對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-gam82接種雞體后淋巴細胞增殖與抗體水平的變化進行了檢測，結(jié)果顯示該核酸疫苗具有一定的免疫原

6、性。 4、重組蛋白gam82-Y和核酸疫苗pcDNA3.1-gam82的免疫保護效果 以黃羽肉雞為試驗動物，設計了2個試驗，以平均增重、相對增重率與相對卵囊產(chǎn)量等為評價指標，分別對重組蛋白和核酸疫苗的免疫保護效果進行了初步研究。結(jié)果顯示：中劑量重組蛋白佐劑組和重組蛋白中劑量組的免疫保護力低于卵囊免疫組(P<0.05)，但好于其他各免疫組(P<0.05)；核酸疫苗(pcDNA3.1-gam82)組在增重、卵囊減少率等方面相