小西葫蘆黃化花葉病毒羅漢果分離株及轉(zhuǎn)基因羅漢果的研究.pdf

1、小西葫蘆黃化花葉病毒(Zucchiniyellow mosaic virus，ZYMV)為馬鈴薯Y病毒科Y病毒屬的成員之一，是葫蘆科作物重要的病原病毒之一。ZYMV單獨(dú)或與其他病毒一起侵染羅漢果，引起羅漢果(Siraitia grosvenorii)病毒病。為了明確羅漢果ZYMV(ZYMV-LHG)病毒病的流行規(guī)律和侵染源，本研究開展了羅漢果全生育期田間病毒病發(fā)生情況監(jiān)測，并對羅漢果田塊內(nèi)和周邊植物進(jìn)行廣泛的病毒血清學(xué)檢測；對來自不同羅

2、漢果種植區(qū)的侵染羅漢果的ZYMV的外殼蛋白(CP)基因序列進(jìn)行分析，以明確ZYMV-LHG在分子水平上的分化程度；同時，對羅漢果抗病毒轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行了初步探索。
　　 本研究于2006年5月、7月和9月分別對廣西桂林的永福和廣西柳州的融安兩地的7個羅漢果果園進(jìn)行了羅漢果全生育期田間病毒病發(fā)病率調(diào)查。在生長前期，宿根苗已全部發(fā)病，但組培苗均未見發(fā)?。簧L中期，有宿根苗的果園的病毒病發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到100%，田間長勢相對較弱，與其鄰近

3、的果園發(fā)病率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于周圍無宿根苗的果園。生長后期，所有羅漢果果園都能看到發(fā)病羅漢果植株，發(fā)病率從0.8%到100%不等。
　　 用提純的ZYMV-LHG病毒粒子免疫新西蘭大白兔，獲得效價(jià)1:16000的抗血清。用ZYMV-LHG抗血清對羅漢果果園及周圍植物進(jìn)行帶毒率檢測，在46科96屬的114種植物中，發(fā)現(xiàn)分別屬于葫蘆科、莧科、豆科、菊科、禾本科、蓼科、錦葵科、鴨跖草科和茜草科共9個科的部分植物呈陽性反應(yīng)，植物陽性檢出率與田間

4、羅漢果的病情發(fā)展趨勢一致，表明ZYMV-LHG有較廣泛的自然寄主范圍。對羅漢果種子傳播ZYMV-LHG的效率進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，ZYMV不能夠通過羅漢果種子進(jìn)行傳播或者其傳播的概率很低。
　　 為了解ZYMV-LHG的進(jìn)化規(guī)律，對從桂林的永福、龍勝和興安三個縣的15個果園采集的表現(xiàn)典型花葉病癥狀羅漢果的ZYMV-LHG的不同分離物進(jìn)行了基因序列分析。以病葉總RNA為模板，通過RT-PCR的方法獲得17條來源于獨(dú)立樣品ZYMV-

5、LHG的外殼蛋白(CP)基因序列，它們的核苷酸序列同源性為92.1%-100%，氨基酸序列同源性為96.4%-100%。利用Dnasp進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ZYMV-LHG CP基因的5’端具有較高的多樣性，Tajima's D統(tǒng)計(jì)值為0.44664，表明ZYMV-LHG核苷酸序列的進(jìn)化為平衡選擇，沒有群體擴(kuò)張的傾向。此外，這17條序列的蚜傳保守DAG基序均未發(fā)生改變，暗示它們均可以通過蚜蟲傳播。線性抗原表位預(yù)測顯示，在ZYMV-LHG的CP的

6、N端，線性抗原表位發(fā)生較多變化，17個分離物可以分為6種不同的抗原類型，其中Ⅰ型最多，包括了6、7、8、9、12、N10-1和N10-4共7個分離物。
　　 用基于距離的鄰近法(neighbor joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹和用貝葉斯-馬爾科夫鏈-蒙特卡洛方法(Bayesia MCMC)對ZYMV-LHG的最近共同祖先出現(xiàn)時間進(jìn)行了估計(jì)。世界各地已報(bào)道的ZYMV的各種株系的最近共同祖先的出現(xiàn)時間為736年(95%HPD，

7、256-1357年)，核酸替代率為1.7×10-4替代/每位點(diǎn)/每年(95%HPD，0.723-3.11×10-4替代/每位點(diǎn)/每年)。MCC樹分析表明，而本研究獲得的ZYMV-LHG分離物主要?dú)w于兩個基因簇群，并且沒有明顯的雜和其他來源的病毒，ZYMV-LHG在進(jìn)化上處于比較保守的位置。
　　 本研究比較了羅漢果子葉、羅漢果實(shí)生苗葉盤和羅漢果組培苗葉盤三種外植體的再生頻率，發(fā)現(xiàn)羅漢果子葉具有再生能力強(qiáng)，再生效率高的特點(diǎn)，最適合

8、作為羅漢果轉(zhuǎn)化體系的外植體，以羅漢果子葉為外植體，60 mg/L的卡那霉素(km)濃度為篩選壓力。本研究所構(gòu)建的羅漢果遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為今后羅漢果基因工程抗病毒育種奠定了初步基礎(chǔ)。選擇ZYMV的NIb和CP最保守的區(qū)域并分析它們的二級結(jié)構(gòu)后，確定并獲得了轉(zhuǎn)基因用RNAi所需的目的片段。以pBI121為載體，構(gòu)建分別攜帶ZYMV的NIb和CP的RNAi片段的雙元表達(dá)載體pBI121ZYMVCPRNAi和pBI121ZYMVNIbRNAi。通