花椰菜突變體創(chuàng)制及幼苗不同部位再生能力差異的表觀遺傳學(xué)研究.pdf

1、花椰菜是蕓薹屬的一種重要蔬菜，且具有抗癌活性成分，深受廣大消費者喜愛。但種質(zhì)資源匱乏，基礎(chǔ)研究薄弱，已成為其新品種培育的重要限制因素?；诖耍狙芯吭噲D建立花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化體系，采用T-DNA插入法創(chuàng)制花椰菜突變體。在此基礎(chǔ)上，以在體外再生能力方面表現(xiàn)出明顯差異的花椰菜幼苗下胚軸和子葉為研究對象，從表觀遺傳學(xué)角度對影響花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素--外植體再生能力進行探究。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.建立了基于農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染的的

2、花椰菜遺傳轉(zhuǎn)化體系，并以體外再生能力強的下胚軸為侵染對象，進行激活標簽T-DNA載體pSKI015遺傳轉(zhuǎn)化，通過除草劑Basta等抗性篩選，初步獲得了一批陽性轉(zhuǎn)化株。
　　 2.采用MSAP分析方法對花椰菜幼苗下胚軸和子葉兩個不同部位的基因組DNA甲基化水平和模式特征進行了分析。共檢測到1183個位點，其中下胚軸中發(fā)生胞嘧啶甲基化的位點占總位點的49.11％，而子葉中為46.49％，表明花椰菜下胚軸和子葉基因組DNA甲基化水平存

3、在一定差異。進一步DNA甲基化模式分析顯示，與子葉相比，下胚軸中19.7％的位點發(fā)生了甲基化或超甲基化模式調(diào)整，而存在15.4％的位點發(fā)生了去甲基化模式調(diào)整。由于花椰菜幼苗下胚軸和子葉具有相同的基因組結(jié)構(gòu)，因此推測二者在DNA甲基化水平與模式特征方面表現(xiàn)出的差異可能與二者的組織特異性或體外再生能力差異有直接關(guān)系。
　　 3.隨機挑選10個DNA甲基化模式在下胚軸和子葉間表現(xiàn)為差異的位點進行片段回收、克隆及測序。序列分析表明，10

4、個位點中9個點可能代表有編碼功能的基因或轉(zhuǎn)錄因子。進而對其中7個轉(zhuǎn)錄表達特征進行了分析。qRT-PCR結(jié)果顯示，其中五個位點在下胚軸和子葉中的轉(zhuǎn)錄表達情況與其對應(yīng)的DNA甲基化模式呈負相關(guān)，暗示DNA甲基化修飾可能參與了這些位點所代表基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 4.采用同源克隆法，對花椰菜中三個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET、DRM、CMT進行了分離、克隆，并對其在花椰菜幼苗下胚軸和子葉中的表達進行了qRT-PCR分析。結(jié)果表明，與DNA甲

5、基化狀態(tài)特征分析結(jié)果一致，主要負責CG位點DNA甲基化的MET在下胚軸中的表達顯著高于在子葉中的表達。
　　 5.利用新一代高通量測序技術(shù)，對花椰菜幼苗下胚軸和子葉全基因組小RNA進行了測序及生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，花椰菜幼苗下胚軸和子葉中小RNA的分布特征存在一定差異。重點對miRNA的分析表明，在下胚軸和子葉中共檢查到來自31個miRNA家族的101個已知miRNA，這其中42個miRNA在二者間表達存在顯著差異。另外，根

6、據(jù)miRNA前體生物學(xué)特征，共預(yù)測到15個novel miRNA，其中7個為二者所共有。進一步依托花椰菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對已知及新預(yù)測miRNA的靶基因進行了預(yù)測及GO、KEGG等功能注釋分析。結(jié)果顯示大量靶基因在組織分生能力形成、維持等與再生能力相關(guān)的功能注釋條目中顯著富集。
　　 6.在對小RNA測序數(shù)據(jù)深入分析基礎(chǔ)上，進一步采用莖環(huán)PCR等手段對miRNA預(yù)測結(jié)果的可靠性進行了實驗驗證。并對多個可能參與花椰菜幼苗下胚軸和子葉體外