雙生病毒衛(wèi)星DNA編碼的βC1蛋白的生化特性研究.pdf

1、菜豆金色花葉病毒屬病毒(begomoviruses)是一類具有重要經(jīng)濟價值的單鏈環(huán)狀DNA植物病毒。近年來,隨著B型和Q型煙粉虱迅速在世界各地擴散begomoviruses也急劇全球蔓延。βC1蛋白是單組份begomoviruses相伴隨的衛(wèi)星DNA分子編碼的一個具有多種功能的蛋白,包括癥狀決定因子、RNA沉默抑制子和運動蛋白等。為了進一步弄清βC1蛋白的功能,本論文以中國番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl C

2、hina virus,TYLCCNV)Y10分離物相伴隨的betasatellite編碼的βC1蛋白(Y10βC1)為研究對象對它的生理、生化性質等進行了研究。
　　 用原核表達系統(tǒng)表達了Y10βC1蛋白,經(jīng)Ni-NTA Agrose、凝膠過濾和Heparin親和層析純化了Y10βC1重組蛋白。利用凝膠過濾層析和戊二醛介導的化學交聯(lián)法對Y10βC1的多聚狀態(tài)進行了體外分析,發(fā)現(xiàn)Y10βC1以多聚體的形式存在于溶液中.非還原SDS

3、-PAGE結果表明Y10βC1的多聚化與二硫鍵無關。以雙分子熒互補試驗(BiFC)和in vivo化學交聯(lián)法對Y10βC1的多聚狀態(tài)進行了體內(nèi)分析,發(fā)現(xiàn)Y10βC1以多聚體的形式存在于本氏煙(Nicotianabenthamiana)細胞質中,但是細胞核中可能以單體或低聚態(tài)存在,說明βC1蛋白可能在細胞核和細胞質中采取了不同的構象以執(zhí)行不同的功能。用PredictProtein等軟件對Y10βC1蛋白的二級結構進行了預測,發(fā)現(xiàn)Y10βC

4、1包括5個β折疊片和2個α螺旋,其中4個β折疊片位于Y10βC1蛋白的氨基端結構域中,而2個α螺旋和最后1個β折疊片位于Y10βC1蛋白的碳端結構域中碳端結構域中。以Y10βC1蛋白的氨基端結構域和碳端結構域突變體進行BiFC發(fā)現(xiàn)Y10βC1的多聚化由碳端結構域中的兩個α螺旋介導。PVX侵染實驗表明多聚化是Y10βC1蛋白誘導begomovirus類似癥狀所必須的,同時僅僅多聚化結構域不能誘導產(chǎn)生begomovirus類似癥狀。生物信息

5、學分析和凝膠過濾層析結果表明多聚化是除有betasatellite編碼的βC1蛋白的一個共同特性,并提出了兩和可能的多聚化模型。利用電泳遷移率變動試驗(EMSA)和核酸酶-交聯(lián)實驗對Y10βC1蛋白的RNA結合特性進行了分析,發(fā)現(xiàn)Y10βC1蛋白可以結合單鏈RNA;農(nóng)桿菌介導的瞬時表達沉默誘導實驗表明Y10βC1蛋白不能抑制dsRNA激發(fā)的RNA沉默,這些結果表明Y10βC1蛋白可能通過全新的機制抑制RNA沉默。
　　 最后,利

6、用蛋白質結晶的手段嘗試了Y10βC1、氨基端整合麥芽糖結合蛋白(MBP)的βC1(MBP-Y10βC1)、Y10βC1與DNA、Y10βC1與AS1、Y10βC1與AS1與DNA共結晶,且獲得了MBP-Y10βC1的晶體并進行了結構的解析,結果表明晶體中只含有MBP蛋白而沒有Y10βC1,說明Y10βC1不穩(wěn)定。此外,獲得了AS1與DNA復合體的晶體,但還需要對結晶條件進行進一步的優(yōu)化以提高晶體的分辨率。
　　 本研兗發(fā)現(xiàn)βC1