雙生病毒衛(wèi)星DNA與脈突和耳突癥狀相關(guān)的遺傳決定因子研究.pdf

1、雙生病毒/DNAβ病害復(fù)合體在自然寄主上能誘導(dǎo)不同的癥狀表型。煙草曲莖病毒(Tobaccocurlyshootvirus，TbCSV)/DNAβ在煙草和番茄上能引起曲葉癥狀，而中國番茄黃化曲葉病毒(TomatoyellowleafcurlChinavirus，TYLCCNV)/DNAβ除引起曲葉外還引起寄主的脈突和耳突癥狀。為了確定癥狀差異的遺傳決定因子，對TbCSV/DNAβ和TYLCCNV/DNAβ進(jìn)行了假重組試驗(yàn)，結(jié)果表明脈突和耳

2、突的表型是由TYLCCNVDNAβ決定的。DNAβ互補(bǔ)鏈上編碼一個保守的ORF，即βCl，對TYLCCNVDNAβ的βCl的突變發(fā)現(xiàn)它編碼一個癥狀決定因子，表達(dá)TYLCCNVDNAβ的βCl的轉(zhuǎn)基因煙草產(chǎn)生曲葉、畸形和葉背面組織增生等發(fā)育異常的表型，而大部分轉(zhuǎn)化TbCSVDNAβ的βCl基因的煙草和番茄植株均與正常植株類似，只有少數(shù)煙草表現(xiàn)出輕微葉上卷表型。為了進(jìn)一步定位DNAβ上決定癥狀的遺傳決定因子，利用OverlapExtensi

3、onPCR的方法對兩個衛(wèi)星的βClORF及其上游約430nt的片段(包含A-rich區(qū)和βCl基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游173nt或200nt的片段，簡稱為片段AP)分別進(jìn)行了互換。構(gòu)建嵌合體衛(wèi)星的侵染性克隆，分別與輔助病毒TbCSV和TYLCCNV共同接種煙草和番茄。嵌合有TbCSVDNAββCl的TYLCCNVDNAβ喪失了誘導(dǎo)脈增厚和耳突表型的能力；嵌合有TYLCCNVDNAββCl或AP片段的TbCSVDNAβ也不能誘導(dǎo)植株產(chǎn)生典型的

4、脈增厚和耳突。而嵌合TbCSVAP片段的TYLCCNVDNAβ則產(chǎn)生了耳突，但是耳突的數(shù)量減少、大小變小，并延遲產(chǎn)生。通過組織化學(xué)法和熒光光度法測定啟動子的活性，發(fā)現(xiàn)TbCSVDNABββCl基因上游的全長片段擁有啟動子活性，它能驅(qū)動GUS在轉(zhuǎn)基因煙草中組成型表達(dá)。Southern印跡分析說明了所有嵌合體衛(wèi)星均能系統(tǒng)侵染寄主植物，而且無論是輔助病毒還是衛(wèi)星分子，其在植物體內(nèi)的積累量與病害復(fù)合體引起的表型差異無關(guān)。上述結(jié)果表明，DNAβ編

5、碼的βCl蛋白對病害復(fù)合體TbCSV/DNAβ和TYLCCNV/DNAβ產(chǎn)生的癥狀差異起主導(dǎo)作用，但βCl的啟動子也能影響癥狀誘導(dǎo)。 對接種含TYLCCNVDNAββCl的PVX(PVX-Y10βCl)和PVX空載體的本氏煙植株分別提取RNA，進(jìn)行miRNA芯片分析，結(jié)果表明，與楊樹miR398b、番茄miR397、擬南芥miR397a以及擬南芥miR166a序列同源的miRNA積累量在兩個樣品之間存在顯著性差異。Norther