不結(jié)球白菜冷誘導(dǎo)差異表達(dá)基因的篩選及功能分析.pdf

1、隨著全球極端災(zāi)害性天氣頻發(fā)，冷害成為蔬菜生產(chǎn)上的一個(gè)嚴(yán)重問題，造成蔬菜品質(zhì)下降以及嚴(yán)重減產(chǎn)，直接影響冬、春季蔬菜周年供應(yīng)。冷害影響植物的生長和發(fā)育，包括:滲透脅迫和次級(jí)脅迫如過氧化物脅迫等，常常導(dǎo)致植物細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)破壞、膜脂相變、細(xì)胞水分虧缺、體內(nèi)酶的活性降低和光合速率下降。但植物對(duì)冷害脅迫的響應(yīng)并非是完全被動(dòng)的，為了適應(yīng)抵抗冷害，植物在長期的進(jìn)化過程中，形成了相應(yīng)的保護(hù)機(jī)制。對(duì)模式植物擬南芥的研究表明，冷馴化是一個(gè)由眾多基因協(xié)同調(diào)控，

2、有著復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的過程，其中少數(shù)關(guān)鍵性調(diào)控基因控制著大量基因的表達(dá)。
　　 不結(jié)球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)經(jīng)過一段零度以上的冷誘導(dǎo)，即冷馴化過程，可以獲得一定的抗寒能力，但對(duì)其機(jī)理的研究較少。采用cDNA-AFLP技術(shù)，以不結(jié)球白菜抗寒自交系043為材料，從轉(zhuǎn)錄組水平上分離冷誘導(dǎo)差異表達(dá)的相關(guān)基因，為探明不結(jié)球白菜冷馴化的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:

3、r>　　 1.不結(jié)球白菜冷誘導(dǎo)相關(guān)基因差異表達(dá)的cDNA-AFLP分析
　　 采用cDNA-AFLP技術(shù)，對(duì)不結(jié)球白菜抗寒自交系043在冷誘導(dǎo)(4℃)下差異表達(dá)的基因進(jìn)行了分析，256對(duì)引物組合共篩選了9960個(gè)cDNA片段，獲得差異片段77個(gè)。其中上調(diào)表達(dá)的基因片段為57個(gè)，下調(diào)表達(dá)的基因片段為20個(gè)。對(duì)其功能比對(duì)發(fā)現(xiàn)，這些TDFs分別參與了基礎(chǔ)代謝、光合作用和能量、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝、防御響應(yīng)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，另

4、外還有一些假想和功能未知蛋白。同時(shí)選取TDF16#、TDF21#和TDF57#進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析，結(jié)果表明這三個(gè)TDFs受冷脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，在不結(jié)球白菜冷馴化過程中可能具有重要作用。構(gòu)建了不結(jié)球白菜在冷誘導(dǎo)下的基因表達(dá)譜，從轉(zhuǎn)錄組水平上鑒定了一批冷誘導(dǎo)相關(guān)基因，這些新基因可用于冷馴化的分子機(jī)理研究。
　　 2.不結(jié)球白菜冷誘導(dǎo)相關(guān)基因BcWRKY46的克隆及功能分析
　　 WRKY轉(zhuǎn)錄因子能廣泛地參與植物的生物與非生

5、物脅迫反應(yīng)。以cDNA-AFLP技術(shù)，從不結(jié)球白菜抗寒自交系043冷誘導(dǎo)(4℃)的葉片中得到的一個(gè)差異表達(dá)片段TDF21#，進(jìn)一步利用RACE技術(shù)獲得了該基因cDNA全序列1175 bp，包含有855bp的開放閱讀框，編碼284個(gè)氨基酸，命名為BcWRKY46。qRT-PCR結(jié)果表明，該基因表達(dá)不僅受冷脅迫誘導(dǎo)，還響應(yīng)其它脅迫，包括鹽、干旱和ABA。過量表達(dá)BcWRKY46的轉(zhuǎn)基因煙草提高了抗寒、鹽、干旱和ABA脅迫的能力。結(jié)果表明，B

6、cwRKY46在提高ABA和非生物脅迫的抗性過程中有著重要的作用。
　　 3.不結(jié)球白菜冷誘導(dǎo)相關(guān)基因BcMCSU的克隆及功能分析
　　 采用cDNA-AFLP技術(shù)，從不結(jié)球白菜抗寒自交系043冷誘導(dǎo)(4℃)的葉片中得到的一個(gè)差異表達(dá)片段TDF16#，進(jìn)一步利用RACE技術(shù)獲得了該基因全長序列1194 bp，包含有926 bp的開放閱讀框，編碼307個(gè)氨基酸，命名為BcMCSU。其氨基酸序列與擬南芥AtMCSU編碼的氨基

7、酸序列具有較高同源性。蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明:所推導(dǎo)的氨基酸序列具有完整的結(jié)構(gòu)，在其N-端和C-端分別含有一個(gè)MOSC結(jié)構(gòu)域。采用Gateway技術(shù)構(gòu)建植物過量表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真空滲透法將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，經(jīng)除草劑篩選，獲得了抗性轉(zhuǎn)基因擬南芥。
　　 4.不結(jié)球白菜冷誘導(dǎo)相關(guān)基因BcVIN3的克隆及功能分析
　　 采用cDNA-AFLP技術(shù)，從不結(jié)球白菜抗寒自交系043冷誘導(dǎo)(4℃)的葉片中得到的一個(gè)差異表達(dá)片