脫氧核酶對鴨甲肝病毒IRES元件的靶向抑制作用研究.pdf

1、為尋找基因水平治療鴨甲肝病毒(DHAV)的可行性靶位點，我們對DHAV的內部核糖體進入位點序列(Internal Ribosome Entry Site，IRES)元件設計合成了6條（DZ369、DZ454、DZ514、DZ454-7、DZ454-9和DZ000）脫氧核酶(DNAzyme)，開展了DNAzyme對IRES元件切割、對DHAV復制的抑制作用研究，獲得如下結果。
　　以構建的pGEM-T/IRES質粒為模板，通過T7體

2、外轉錄試劑盒進行體外轉錄得到含有IRES結構元件的RNA單鏈產物（DHAV-RNA），長度約為361nt，在金屬離子Mg2+存在的情況下，DHAV-RNA與DNAzyme進行相互作用后5.0％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果顯示具有完整的酶切活性中心和與底物完全互補配對的側翼結構的DZ369、DZ454和DZ514均能在靶RNA的G-C或者A-C位點進行切割反應，而只有完整酶切活性中心不具備切割底物的識別結構域的無關對照組DZ000，不能對

3、靶RNA進行有效切割，表明DNAzyme對IRES的切割反應具有很強的特異性。
　　DNAzymes需要二價金屬離子的輔助才能更好地發(fā)揮作用，并且在不同金屬離子的作用下，DNAzymes對IRES表現(xiàn)出不同的切割活性，其中Mg2+對DNAzymes的活性表現(xiàn)出最強的促進作用，其余依次是Zn2+、Mn2+、Ni2+和Co2+。
　　將含有IRES結構元件的目的基因和Red基因克隆到pEGFP-N1中，得到雙表達載體pEGFP-

4、Red-IRES-N1并轉染DEF細胞中，成功表達出Red和EGFP熒光蛋白。與陽性對照組相比，重組克隆載體的綠色熒光蛋白的表達量只能到達對照組的60-65％，且IRES依賴性的EGFP開始表達的時間比帽子依賴性的時間更延后，說明IRES能起始其下游基因的表達，但是活性沒有CMV啟動子的強。
　　隨后將雙表達載體pEGFP-Red-IRES-N1和DNAzyme共轉染DEF細胞，發(fā)現(xiàn)轉染DNAzyme的試驗組中EGFP表達受到了抑

5、制，最強抑制作用出現(xiàn)在10μmol/L的DZ454組，而DNAzyme側翼長度的改變沒有影響其活性。與對照組相比Red蛋白的表達量沒有差異，表明IRES起始的蛋白的表達是相對獨立的。
　　另外一個重要的結果是在DZ454對DHAV-1全病毒復制的抑制作用的試驗中，用一步熒光定量RT-PCR(FQRT-PCR)的方法檢測細胞碎片中不同時間點3D基因的表達情況。結果顯示，到第60 h時病毒的復制量達到最大值，之后保持不變，且在病毒復制