擬南芥MAP65-6和TUA-6基因轉(zhuǎn)化煙草的初步研究.pdf

1、植物細(xì)胞形態(tài)建成（cell morphogenesis）是植物的生長發(fā)育過程中細(xì)胞發(fā)揮特殊功能的必要條件，細(xì)胞骨架在細(xì)胞形態(tài)建成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。細(xì)胞骨架包括微管、微絲和中間纖維，其中微管在細(xì)胞分裂、分化、細(xì)胞形態(tài)決定及胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)壬砘顒又衅鹬匾饔?。植物?xì)胞有不同于動物細(xì)胞的微管陣列，如周質(zhì)微管、早前期帶、紡錘體微管和成膜體微管。在植物細(xì)胞的形態(tài)建成中，微管陣列會依次轉(zhuǎn)換。微管陣列的轉(zhuǎn)換需微管蛋白（tubulin）和微管相關(guān)蛋白（m

2、icrotubule-associated protein）的參與。
　　 本文通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法將MAP65-6-GFP、GFP-TUA-6和TUA-6-GFP轉(zhuǎn)入煙草植株。
　　 針對煙草NC89，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化體系的改進(jìn)。改進(jìn)后的方法：煙草子葉先在黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)2d，用OD600為0.7的農(nóng)桿菌侵染5min，再在黑暗條件下共培養(yǎng)2d，用合理有效的脫菌方式進(jìn)行脫菌，再分別轉(zhuǎn)入含有不同激素和抗生素濃度梯度的愈傷

3、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選?？偣搏@得了88株轉(zhuǎn)化植株。
　　 對36株MAP65-6-GFP轉(zhuǎn)化煙草植株進(jìn)行PCR檢測，17株為陽性植株，轉(zhuǎn)化率達(dá)47％。挑選其中的5株陽性植株進(jìn)行Southern blot檢測，有3株有雜交信號。取雜交信號強(qiáng)的植株用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)MAP65-6-GFP主要定位在細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)微管中。
　　 在33株GFP-TUA-6轉(zhuǎn)化煙草植株中，12株為PCR檢測陽性植株，

4、轉(zhuǎn)化率達(dá)36％。挑選其中的5株陽性植株進(jìn)行Southern blot檢測，有3株有雜交信號。取雜交信號強(qiáng)的植株用激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)GFP-TUA-6主要定位在周質(zhì)微管中。
　　 在19株TUA-6-GFP轉(zhuǎn)化煙草抗性植株中，4株為PCR檢測陽性植株，轉(zhuǎn)化率僅為21％。然后再進(jìn)行Southern blot檢測，有3株有雜交信號。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TUA-6-GFP在根的細(xì)胞質(zhì)和周質(zhì)微管中熒光都很強(qiáng)。