中國番茄黃曲葉病毒衛(wèi)星編碼βC1蛋白的寄主互作因子鑒定.pdf

1、中國番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是一種伴隨有衛(wèi)星DNA的單組份雙生病毒，在自然界以TYLCCNV/TYLCCNVbetasatellite(TYLCCNB)病害復合體的形式侵染寄主。TYLCCNV/TYLCCNB能夠在番茄和煙草等多種植物上引起曲葉、黃化、葉脈增厚、耳突以及矮化等癥狀，而TYLCCNB互補鏈上編碼的βCl蛋白是癥狀決定因子。
　　 為了更好

2、地了解TYLCCNV/TYLCCNB病毒復合體在番茄上的致病機理以及番茄在抵御病毒入侵過程中產生的防衛(wèi)反應，本研究首先通過提取番茄總RNA并構建了番茄cDNA文庫。隨后以病毒致病因子βCl蛋白為誘餌在番茄cDNA文庫中篩選與βCl蛋白互作的寄主因子，獲得157個陽性酵母菌落，共包含了113條番茄寄主因子的cDNA信息，其中有48條為功能已知蛋白的cDNA序列。從釣取到的48種潛在互作因子中挑取了10種用于全長基因的克隆以及與βCl蛋白互

3、作的驗證，最終發(fā)現番茄的一種E3泛素連接酶RING finger蛋白SlRFP和一種絲/蘇氨酸蛋白激酶SlSnRK1能夠與βCl蛋白發(fā)生特異性相互作用。
　　 對TYLCCNBβCl與番茄RING finger蛋白SlRFP的互作機制進行了初步分析。通過酵母雙雜交以及雙分子熒光互補試驗證實βCl與全長SlRFP蛋白在體外和體內條件下均能夠發(fā)生互作。隨后根據SlRFP的二級結構和保守功能區(qū)設計了5個突變體用于分析SlRFP中與βC

4、l蛋白互作的位點，結果表明SlRFP蛋白的RING tinger結構域(第448～481氨基酸)是βCl蛋白的主要結合位點。SlRFP基因在番茄的不同組織中均有表達但表達量存在差異，同時還發(fā)現SlRFP蛋白是一種核質共定位蛋白。通過熒光定量PCR試驗證實TYLCCNV/TYLCCNB復合體的侵染能夠導致番茄SlRFP基因的表達量提高。
　　 為了進一步分析TYLCCNBβCl與SlSnRK1的互作機理，根據SlSnRK1和TYL

5、CCNBβCl的二級結構以及保守功能區(qū)分別設計了9個和8個突變體，用于分析二者互作所需的區(qū)域。酵母雙雜交結果顯示，TYLCCNBβCl與SlSnRK1的N端激酶結構域(第1～280氨基酸)并不存在明顯的互作，而與SlSnRK1 C端的泛素相關結構域(第281～339氨基酸)和自我抑制結構域(第340～449氨基酸)互作；對TYLCCNBβCl與SlSnRK1互作的結構域分析表明，βCl蛋白的完整結構是與SlSnRK1互作所必需的。