轉(zhuǎn)尖音庫蚊羧酸酯酶及其突變基因果蠅的殺蟲劑抗性研究.pdf

1、蚊蟲由于其特殊的行為、生理以及與人類生活關系緊密而成為傳播人類疾病如絲蟲病、乙型腦炎、西尼羅河病毒、登革熱、瘧疾等的重要媒介。殺蟲劑對控制這些人類疾病的主要傳播媒介起著重要的作用,然而由于這些蚊蟲通常具有強大的生殖力和遺傳的可塑性從而適應多種嚴酷自然環(huán)境的變化而生存。自20世紀以來多種化學殺蟲劑(有機氯類、有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類等)和生物殺蟲劑的使用,使得蚊蟲與這種環(huán)境變化協(xié)同進化——通過生理生化多種機制產(chǎn)生抗藥性,以適應

2、各種選擇壓。蚊蟲抗藥性的分子機理主要包括兩個方面:代謝抗藥性(如非特異性羧酸酯酶、P450單加氧酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的擴增)和靶標抗藥性(如乙酰膽堿酯酶、GABA受體和電壓門控鈉離子通道的突變)?？顾幮詥栴}的出現(xiàn)和加劇不僅縮短了當前正在使用的殺蟲劑的壽命,而且由于交叉抗性和抗性機制的多元化,新開發(fā)的殺蟲劑的功效和使用壽命也被大大降低。
　　 目前,已經(jīng)證實了果蠅的DmαE7a、家蠅的MdαE7、羊綠蠅的LcαE7及在體外蚊蟲的

3、羧酸酯酶B1都可以通過點突變獲得有機磷水解酶的活性。然而,尖音庫蚊野生種群里還未檢測到這種突變體,所以在自然進化中羧酸酯酶B1的突變能否給尖音庫蚊帶來相應的抗藥性仍存在著爭議。為解決這一問題,本研究利用果蠅模型,對羧酸酯酶B1的突變對蚊蟲抗藥性的影響及其遺傳進化進行了探討。
　　 通過生物信息學分析,首先確定了蚊蟲羧酸酯酶B1與果蠅羧酸酯酶的氨基酸序列具有較低的同源性(13％-41％)。利用GAL4／UAS系統(tǒng),通過顯微注射成功

4、構建了轉(zhuǎn)尖音庫蚊羧酸酯酶B1W271及其突變基因B1L271的果蠅品系,經(jīng)過P因子定位,分別得到12瓶和14瓶位于Ⅱ和Ⅲ染色體上的轉(zhuǎn)基因果蠅。實時定量PCR顯示,B1W271(Ⅱ)、B1W271(Ⅲ)、BU271(Ⅱ)和B1L271(Ⅲ)四個轉(zhuǎn)基因果蠅品系插入的基因都是單拷貝,在轉(zhuǎn)錄水平上也沒有顯著性差異。利用兔抗尖音庫蚊羧酸酯酶B1多克隆抗體,用Western-blot檢測了轉(zhuǎn)基因果蠅品系的表達水平,發(fā)現(xiàn)B1W271(Ⅱ和Ⅲ)的表達量

5、顯著高于B1L271(Ⅱ和Ⅲ),只檢測到B1L271(Ⅱ和Ⅲ)微弱的表達量。經(jīng)過淀粉凝膠電泳對羧酸酯酶進行活性顯色,發(fā)現(xiàn)B1W271(Ⅱ和Ⅲ)的羧酸酯酶活性明顯高于B1L271(Ⅱ和Ⅲ),大約是B1L271(Ⅱ和Ⅲ)的2-3倍,說明B1W271在突變之后喪失了原有的羧酸酯酶活性。通過對馬拉硫磷、1605、溴氰菊酯三種農(nóng)藥的生物測定發(fā)現(xiàn),B1L271對馬拉硫磷的抗藥性明顯高于B1W271,對1605和溴氰菊酯都沒有產(chǎn)生抗藥性,說明B1L2