石斛AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子的基因克隆與功能初步分析.pdf

1、石斛屬（Dendrobium）植物是蘭科的附生植物，它是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，并且它還具有較高的觀賞價值。AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子是一類非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，該家族成員都含有1-2個高度保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域，與植物的生長發(fā)育和脅迫應答密切相關(guān)。
　　 本研究從石斛文庫中篩選得到3條AP2/EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子cDNA，分別命名為TEREB5、JEREB1和AP1，其中本文的主體研究對象為TEREB5。根據(jù)TERE

2、B5已知的序列信息設(shè)計特異引物，運用5’RACE法克隆得到長度為265bp的5’端序列，拼接得到完整序列。序列分析表明，TEREB5具有一個558bp的開放閱讀框，編碼186個氨基酸殘基，含有一個AP2/EREBP保守結(jié)構(gòu)域，其序列經(jīng)Blast軟件進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子基因與葡萄的ERF7基因( XM_002282279.1)、大豆ERF5基因(HQ896930.1)和擬南芥ERF9基因（NC_003076.8）分別具有81％、

3、78％和75％的同源性。因此TEREB5屬于ERF亞族轉(zhuǎn)錄因子基因。采用Gateway法構(gòu)建TEREB5的超表達和RNA干涉載體，并分別轉(zhuǎn)化擬南芥，利用Barstar和Genotyping對T1和T2代擬南芥進行篩選獲得陽性植株。陽性植株的表型產(chǎn)生變化，RNAi擬南芥植株體積增大，葉柄變長，葉片變大，葉形較圓；超表達擬南芥植株體積縮小，葉柄變短，葉柄與葉片的分界較為模糊，葉形呈細長狀，推測TEREB5可能在擬南芥的生長發(fā)育中起到一個負調(diào)

4、控的作用。RNAi擬南芥的葉綠素含量高于野生型擬南芥，而超表達擬南芥的葉綠素含量又略低于野生型擬南芥，猜測TEREB5可能對葉綠素合成有影響，并且可能對葉綠素合成有一定的抑制作用。通過Real-time PCR分析，TEREB5的超表達會導致擬南芥同源基因ERF9的表達量出現(xiàn)一定程度的降低，推斷TEREB5可能與同源基因ERF9存在功能互補。在RNAi擬南芥植株中TEREB5的表達會導致擬南芥同源基因ERF9的表達量出現(xiàn)明顯降低，說明T