中華蜜蜂谷胱甘肽S-轉移酶和小分子熱激蛋白基因的生物學功能分析.pdf

1、自然生態(tài)環(huán)境的變化使得蜜蜂種群面臨日益嚴峻的生存和延續(xù)考驗。提高蜜蜂自身防御能力是保持蜂群健康發(fā)展的重要前提。中華蜜蜂(Apis cerana cerana)是我國特有的蜜蜂種質資源，對于維護與其有關的植物共生生態(tài)系統(tǒng)的平衡，具有重要的經濟價值和社會效益。本研究基于已經證實的谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferases，GSTs)參與調控生物體的抗氧化功能和小分子熱激蛋白(small heat shock p

2、roteins，sHSPs)在細胞損傷防御及生物保護中執(zhí)行的特殊作用，以中華蜜蜂為實驗材料，開展了GSTO2和sHsp22.6基因的功能研究，從分子水平上探討了中華蜜蜂自身防御能力與其GSTO2和sHsp22.6基因的聯系。具體研究結果與主要結論如下:
　　(1)中華蜜蜂GSTO2基因的分子特性和功能分析
　　根據西方蜜蜂(Apis mellifera Linnaeus)的同源序列，利用RT-PCR和RACE-PCR的方法，

3、從中華蜜蜂中克隆到一個新的Omega族GST基因，命名為AccGSTO2。序列分析表明:該基因cDNA全長為1365bp，包括321bp的5'非翻譯區(qū)、324bp的3'非翻譯區(qū)和720bp的開放閱讀框，編碼一個包含239個氨基酸殘基的多肽，預測分子量和等電點分別為27.785kDa和6.21。中華蜜蜂AccGSTO2的氨基酸序列與其他昆蟲GSTOs有較高的同源性，并具有細胞質GST超家族保守的功能區(qū)域。
　　用TFSEARCH在線

4、軟件程序對分離的AccGSTO2基因啟動子區(qū)域進行了分析，不僅預測到CF2-Ⅱ、BR-C、NIT2等若干與早期組織發(fā)育和生長相關的轉錄因子結合位點，兩個與調節(jié)環(huán)境應激有關的轉錄因子(HSF和AP-1)以及基因表達調控元件（CREB和C/EBP）的結合位點也被發(fā)現。這些結果表明，AccGSTO2基因可能參與蜜蜂的發(fā)育和環(huán)境應激響應。
　　采用qRT-PCR和Western blot的方法研究了中華蜜蜂不同發(fā)育時期和組織中的AccGS

5、TO2基因的表達特性。結果表明，在3日齡幼蟲時期和腦組織中AccGSTO2表達量最高，表明AccGSTO2可能與幼蟲早期發(fā)育及維持蜜蜂腦組織的正常功能相關。
　　應用qRT-PCR的方法探究了AccGSTO2基因在不同生物及非生物應激中的表達特性。結果表明，AccGSTO2基因的轉錄水平受到蜂球囊菌、黃曲霉菌、20羥基蛻皮激素(20E)等生物因素及溫度、紫外線、H2O2、農藥、CdCl2等非生物因素的應激而誘導提高，但HgCl2處

6、理后則出現基因轉錄的抑制現象。Western blot結果在蛋白水平上進一步證實了CdCl2和黃曲霉菌等處理對基因表達的誘導作用，蜜蜂體內氧化狀態(tài)的測定表明這種誘導是氧化應激的結果。綜上結果表明，AccGSTO2基因可能在中華蜜蜂的氧化應激和組織發(fā)育中發(fā)揮重要作用。
　　利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)的方法進一步研究了AccGSTO2基因的生物學功能。將合成的dsAccGSTO2注射到新出房的成年蜜蜂

7、胸部或飼喂3日齡幼蟲，qRT-PCR結果顯示，成年蜜蜂注射后第3天和幼蟲飼喂1天后，AccGSTO2的表達量降低最為顯著。免疫組織化學的結果也發(fā)現成年蜜蜂的頭部、肌肉和中腸，幼蟲的中腸、馬氏管和脂肪體細胞的表達量相比對照組明顯減少。上述處理組蜜蜂的抗氧化基因，除Accp45O的轉錄增強外，AccGSTD，AccGSTs4，AccSOD，AccCAT的轉錄水平都出現不同程度的降低。與對照組蜜蜂相比，dsAccGSTO2處理組蜜蜂的H2O2

8、，丙二醛(MDA)含量明顯升高，存活率顯著降低。以上結果一方面表明了dsAccGSTO2處理成功抑制了蜜蜂AccGSTO2基因的表達，同時也表明AccGSTO2基因的敲除破壞了蜜蜂抗氧化體系的平衡，降低了蜜蜂的生存率。
　　采用原核表達載體pET-30a(+)并優(yōu)化誘導表達條件成功獲得了可溶性的AccGSTO2重組蛋白，進一步通過親和層析的方法進行分離純化，純化的重組蛋白的濃度達到1.89mg/mL。酶學特性的分析表明，重組Acc

9、GSTO2不僅具有對通用底物CDNB的谷胱甘肽(GSH)結合活性和以異丙苯-過氧化氫、叔丁基過氧化氫為底物的GSH過氧化物酶活性，還有較高的脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)活性。重組AccGSTO2的最適溫度是25℃、最適pH為7.0。
　　利用混合功能氧化(mixed-function oxidation，MFO)系統(tǒng)和紙盤擴散分析的方法研究了重組AccGSTO2蛋白的抗氧化功能。在MFO實驗中，重組AccGSTO2蛋白以濃度依賴

10、的方式保護質粒DNA免遭系統(tǒng)中產生的羥自由基的剪切，并且發(fā)現這種保護作用與分子中半胱氨酸的巰基有關。紙盤擴散試驗的結果為重組AccGSTO2蛋白在氧化條件下的保護作用提供了進一步的證據。
　　通過定點突變的方法獲得了3個AccGSTO2的突變體:C28A、C124A和C217A。酶動力學和內外熒光光譜學研究的結果發(fā)現，突變體C28A和C124A有明顯的酶活性喪失和最大發(fā)射波長的偏移。MFO系統(tǒng)和紙盤擴散分析的結果為這兩個位點半胱氨

11、酸在AccGSTO2抗氧化功能方面的關鍵作用提供了一個直接證據。3個突變體的三維同源結構模型也提供了一個直觀的證據，突變體的表面電荷分布、疏水性斑塊及空間結構的改變可能是引起其部分功能喪失的重要因素。突變體C217A則與野生型AccGSTO2的功能特性基本相似。以上結果表明Cys28和Cys124在維持AccGSTO2的結構和功能方面發(fā)揮重要作用。
　　(2)中華蜜蜂sHsp22.6基因的分子特性和功能分析
　　利用上述的方

12、法，從中華蜜蜂中克隆到一個新的小分子熱激蛋白基因，命名為AccsHsp22.6。該基因cDNA全長904bp，其中5'非翻譯區(qū)115bp、3'非翻譯區(qū)204bp和開放閱讀框720bp，編碼一個包含194個氨基酸殘基的多肽，預測分子量22.605kDa，等電點5.88。中華蜜蜂sHSP22.6的氨基酸序列與其他昆蟲sHSPs有較高的同源性，并具有sHSP超家族典型的結構特征。
　　通過MatInspector在線軟件程序，在分離的A

13、ccsHsp22.6基因啟動子區(qū)域預測到參與早期組織發(fā)育的轉錄因子結合位點(CF2-Ⅱ、BR-C、CdxA和NIT2)。幾個與環(huán)境應激及免疫響應有關的轉錄因子結合位點(HSF、AP-1、Nrf2、NFκB和p53等)也被發(fā)現。以上結果表明，AccsHsp22.6基因可能參與蜜蜂的早期發(fā)育和應激保護機制。
　　利用qRT-PCR和Western blot的方法研究了AccsHsp22.6基因在不同發(fā)育時期和組織中的表達特性。結果發(fā)現

14、，該基因總是在蜜蜂不同發(fā)育時期的轉型期高水平表達，尤其在新出房的成蟲和中腸組織中表達量最高，表明AccsHsp22.6可能參與蜜蜂發(fā)育時期的轉換及維持中腸組織的正常功能。
　　應用qRT-PCR的方法研究了AccsHsp22.6基因在不同實驗條件下的表達特性。結果表明，AccsHsp22.6基因的轉錄水平在大多數處理中誘導上調，包括熱、冷、紫外線、H2O2、三氟氯氰菊酯、CdCl2等非生物因素和蜂球囊菌、黃曲霉菌、20羥基蛻皮激素

15、(20E)等生物因素。但是該基因在25℃、辛硫磷、百草枯、HgCl2處理后其轉錄沒有明顯的誘導，有時甚至出現抑制的現象。以上結果表明，AccsHsp22.6基因可能在中華蜜蜂應對大多數不利因素的應激保護中發(fā)揮重要作用。
　　利用RNAi的方法進一步研究了AccsHsp22.6基因的生物學功能。將合成的dsAccsHsp22.6注射到新出房的成年蜜蜂胸部，qRT-PCR結果顯示，成年蜜蜂注射后第1-3天，AccsHsp22.6的表達

16、量降低較為顯著。免疫組織化學的結果也發(fā)現，成年蜜蜂的中腸、馬氏管、肌肉和脂肪體細胞的表達量均比對照組明顯減少。在4℃和50℃條件下，dsAccsHsp22.6注射3天后的蜜蜂其存活率與對照組蜜蜂相比顯著降低。以上結果不僅說明AccsHsp22.6基因的表達被有效抑制，而且表明該基因的敲除降低了蜜蜂對極端溫度的耐受能力。
　　采用原核表達載體pET-30a(+)，優(yōu)化誘導表達條件，通過親和層析的方法成功表達并純化了可溶性的AccsH