Ve1-FG人工融合基因的構建和轉化擬南芥研究.pdf

1、小麥是世界性的糧食作物，全世界至少有35％的人口是以小麥為主要糧食的。小麥赤霉病是一種世界潮濕和半潮濕地區(qū)廣泛發(fā)生的一種重要流行性病害。該病害不僅造成減產和品質降低，致病菌所產生的赤霉菌毒素還會污染小麥病粒，嚴重影響食品安全和人畜健康?？钩嗝共∮N仍是控制小麥赤霉病的主要途徑。但小麥抗赤霉病育種仍然面臨著種質資源相對匱乏、抗病品種農藝性狀欠佳及育種周期漫長等困難。
　　 通過植物基因工程可有針對性的將抗病相關基因導入感病品種中改

2、良其抗病性，轉基因工程株可以在保持原有受體品種的農藝性狀的基礎上提高抗病性。因此，本研究試圖利用野生番茄上的抗黃萎病基因(Ve1)和小麥赤霉病的病原菌自身識別基因進行人工重組，并通過誘導表達和Western雜交，以驗證人工重組基因是否正確表達，為后續(xù)在植物體內測試重組基因的功能奠定基礎，探索抗病新策略。取得以下主要研究結果:
　　 根據(jù)在番茄上已經克隆到的抗黃萎病基因(Ve1)的序列，進行結構域分析，推測Ve1基因1525-18

3、20nt為抗病識別區(qū)域;該識別區(qū)域與所抗目標病害黃萎病原菌基因組識別蛋白基因VDBG-096011465-1755nt區(qū)間，一致性為21％（61％為陽性）。小麥赤霉病原菌基因組內存在與VDBG-09601同源的基因FGSG08285，一致性達55％（陽性率69％），但在上述識別區(qū)域內無相似性。本研究通過融合Ve1基因及FGSG_08285基因，以期實現(xiàn)改造后的Ve1基因能夠識別小麥赤霉病菌從而達到抗病的全新策略。為了構建該融合基因，擴增

4、出Ve1基因1-1524nt和1821-3159nt兩個片段以及小麥赤霉病FGSG_08285基因1561-1857nt片段，三個片段大小分別為1524bp，1338bp，297bp。通過Fusion PCR方法構建Ve1-FGSG08285（簡稱Ve1-FG）融合基因，全長為3159bp。經融合蛋白誘導表達及Western雜交，結果表明該融合基因與非融合Ve1基因一致，具有表達活性，為可溶性蛋白，表達產物大小為117KDa，為后續(xù)基因

5、抗病功能測試奠定基礎。利用半定量RT-PCR對該基因的組織表達特異性進行分析，表明Ve1-FG在根和莖中表達量較高，在葉中和果實中表達量較低。
　　 構建植物表達載體pCXSN-Ve1-FG，利用農桿菌花序侵染法轉化模式植物擬南芥;通過潮霉素抗性、PCR及RT-PCR篩選鑒定擬南芥植株，初步證明外源基因已經整合到擬南芥基因組中。對轉基因擬南芥苗進行抗病性分析，結果顯示轉基因擬南芥對禾谷鐮刀菌的抗病性比對照植株強。轉基因擬南芥苗和