豬水腫病毒素Stx2e基因突變體原核表達(dá)及重組蛋白的免疫生物學(xué)特性研究.pdf

1、豬水腫病(Edemadiseaseofswine，ED)是斷奶仔豬的一種急性致死性疾病，主要由產(chǎn)Ⅱ型志賀毒素變異體e亞型(Stx2e，Shigatoxin2e)的大腸桿菌引起。Stx2e是致水腫病大腸桿菌的主要毒力因子。抗毒素免疫可以保護(hù)動(dòng)物免受產(chǎn)毒素大腸桿菌的侵襲，并已經(jīng)成為水腫病研究的重點(diǎn)之一，毒素或類毒素的獲取是研究抗毒素免疫機(jī)制及效果的關(guān)鍵。制備類毒素的方法主要有兩種:一種利用提取的天然Stx2e，然后利用化學(xué)滅活的方法制備，但

2、研究表明利用該法制備的類毒素免疫動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生影響動(dòng)物體重增加或?qū)е麦w重下降的副作用;另外一種是采用基因工程的方法，突變Stx2e的酶活性位點(diǎn)，獲得基因工程法生產(chǎn)的類毒素，這種類毒素不需使用化學(xué)試劑滅活，對(duì)動(dòng)物的體重等生產(chǎn)性能沒有影響。
　　 根據(jù)GeneBank收錄的Stx2eA、B亞基的基因設(shè)計(jì)了四對(duì)引物。一對(duì)用于擴(kuò)增出Stx2eB不包含信號(hào)肽的基因序列，兩對(duì)用于用PCR法將Stx2eA的第167位編碼Glu的密碼子突變?yōu)榫幋aG

3、ln的密碼子，第170位編碼Arg的密碼子突變?yōu)榫幋aLys的密碼子，再用最后一對(duì)引物用PCR重疊延伸法擴(kuò)增出突變的不包含信號(hào)肽的Stx2eA基因序列。將PCR產(chǎn)物分別與克隆載體pMD18-Tsimplevector相連接，重組克隆分別命名為pMD18-T-Amu和pMD18-T-B，經(jīng)酶切鑒定正確后進(jìn)行序列測(cè)定，并將測(cè)序結(jié)果與GeneBank上收錄的Stx2e的A、B基因分別進(jìn)行比對(duì)，A亞基的基因序列同源性結(jié)果在99.0％～99.6％之

4、間，其編碼的氨基酸序列的同源性為98.3％～99.0％，且成功地將第167位的Glu突變?yōu)镚ln，第170位的Arg突變?yōu)長(zhǎng)ys;B亞基的基因序列同源性為99.5％～100％，其編碼的氨基酸序列的同源性為98.6％～100％。
　　 提取克隆載體pMD18-T-Amu和pMD18-T-B，分別對(duì)其進(jìn)行雙酶切，獲得Stx2eAmu和Stx2eB基因片段，將兩目的片段與原核表達(dá)載體pETDuet-1連接，構(gòu)建同時(shí)表達(dá)Stx2eA亞單

5、位（突變體）和B亞單位的質(zhì)粒載體，命名為pET-ABmu，使用兩個(gè)啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)A亞單位和B亞單位在同一載體上表達(dá)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，由SDS-PAGE電泳分析證實(shí)Stx2eAmu和Stx2eB獲得了表達(dá)，蛋白分子量分別約為35kDa和7.5kDa，分別命名為His-Stx2eAmu和Stx2eB，均以包涵體的形式存在，以抗Stx2e血清為一抗，經(jīng)Westen-blot分析證實(shí)表達(dá)的兩段重組蛋

6、白抗原性良好。
　　 用純化的重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB作為免疫原，(對(duì)ICR小鼠進(jìn)行腹腔)注射，以檢驗(yàn)重組蛋白的毒性和免疫原性，免疫結(jié)束用最低致死劑量的Stx2e粗提毒素進(jìn)行攻毒，觀察重組蛋白對(duì)小鼠的免疫保護(hù)性;在Vero細(xì)胞上測(cè)定重組蛋白對(duì)Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性及免疫鼠血清對(duì)Stx2e的中和試驗(yàn)。結(jié)果表明，經(jīng)腹腔注射純化的重組蛋白His-Stx2eAmu和Stx2eB，小鼠無任何癥狀，這表明重組表達(dá)產(chǎn)物對(duì)