BPI基因?qū)嗄套胸iF18大腸桿菌抗性的功能分析.pdf

1、斷奶仔豬腹瀉和水腫病是兩種導(dǎo)致斷奶仔豬死亡的重要傳染性疾病，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌F18菌株是引起這兩種疾病的主要病原菌，從長遠(yuǎn)來看，從遺傳角度上提高豬對(duì)大腸桿菌F18菌株的抗性，并結(jié)合免疫接種控制疾病是一種高效可行的方法。因此，找到能適用于中國地方豬種的F18大腸桿菌抗性功能基因和相關(guān)遺傳標(biāo)記具有十分重要的意義。殺菌通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasingprotein，

2、BPI)不但能夠殺滅革蘭氏陰性菌、中和內(nèi)毒素或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的活性，還可以促進(jìn)補(bǔ)體活化，增強(qiáng)吞噬的調(diào)理功能等一系列生物學(xué)活性，在動(dòng)物機(jī)體的天然防御中起到了很重要的作用。本試驗(yàn)從群體、DNA、mRNA和蛋白水平分析了BPI基因?qū)ωi抗F18大腸桿菌感染的功能及機(jī)理，以期為今后利用其作為遺傳標(biāo)記開展豬抗病育種提供參考和依據(jù)。主要結(jié)果如下:
　　 1.采用PCR-RFLP方法對(duì)野豬和國內(nèi)外10個(gè)豬

3、群體BPI基因第10外顯子HpaⅡ酶切位點(diǎn)遺傳變異進(jìn)行了檢測，共檢測到AA、BB和AB3種基因型，2個(gè)等位基因，其中野豬、藏豬、榮昌豬和淮豬群體中AA基因型為優(yōu)勢基因型，A等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因;外來商業(yè)化豬品種中，杜洛克群體AA基因型頻率較高。序列分析表明AA基因型與GenBank中的序列一致，BB基因型存在A27G同義突變位點(diǎn)和T118G錯(cuò)義突變位點(diǎn)?；贐PI基因的等位基因頻率構(gòu)建11個(gè)豬群體的系統(tǒng)發(fā)生樹，將11個(gè)豬群體分為兩大類

4、:第一類包括野豬、淮豬、藏豬、榮昌豬、杜洛克;第二類包括大白豬、長白豬、楓涇豬、梅山豬、二花臉、蘇太豬。本研究結(jié)果顯示豬群體間基于BPI基因在一般抗性上確實(shí)存在差異，這種差異與體型、生產(chǎn)類型等因素沒有明顯的聯(lián)系。對(duì)BPI基因第10外顯子HpaⅡ酶切位點(diǎn)3種基因型個(gè)體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA基因型中大腸桿菌F18菌株抗性型個(gè)體的頻率為90％，顯著或極顯著地高于AB基因型(57.1％)和BB基因型(17.4％)

5、的個(gè)體，表明BPI基因第10外顯子HpaⅡ酶切位點(diǎn)AA基因型對(duì)大腸桿菌F18菌株抗性是有利基因型。
　　 2.利用課題組前期建立的F18大腸桿菌病抗性和敏感性資源群體，篩選出性狀基本一致的抗性型以及敏感型個(gè)體各8頭，運(yùn)用Real-timePCR方法研究在斷奶仔豬中BPI基因mRNA的各個(gè)組織表達(dá)水平，并比較其在大腸桿菌F18菌株抗性和敏感性斷奶仔豬個(gè)體間的差異表達(dá)情況;同時(shí)選取蘇太豬不同日齡(8日齡、18日齡、30日齡和35日齡

6、)仔豬各8頭，不同品種(梅山豬、大白豬和蘇太豬抗性群體)斷奶仔豬各8頭，分析BPI基因在初生到斷奶不同發(fā)育時(shí)期以及在不同群體間的表達(dá)水平。結(jié)果表明，在對(duì)所有個(gè)體檢測的11個(gè)組織中，BPI基因在心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺、淋巴結(jié)中幾乎不表達(dá)或表達(dá)量很低，但在十二指腸和空腸中表達(dá)量很高。在十二指腸和空腸中，BPI基因在抗性組的表達(dá)量均顯著高于敏感組的表達(dá)量(P＜0.05)。在8日齡，18日齡，30日齡和35日齡4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的蘇太

7、豬中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空腸和十二指腸在4個(gè)不同發(fā)育時(shí)期均高度表達(dá)。在空腸組織中35日齡表達(dá)量顯著高于18日齡表達(dá)量(P＜0.05)，在8日齡、18日齡和30日齡之間表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)。十二指腸中35日齡表達(dá)量顯著高于8日齡、18日齡和30日齡的表達(dá)量(P＜0.05)，8日齡、18日齡和30日齡之間表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)。梅山豬、大白豬和蘇太豬抗性型群體之間BPI基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，空腸和十二指腸在3個(gè)群體中都高度表達(dá)

8、，且BPI基因在蘇太豬抗性型群體中的表達(dá)量顯著高于大白豬和梅山豬的表達(dá)量(P＜0.05)。綜上可見，BPI基因?qū)箶嗄套胸i腸道中大腸桿菌F18菌株的感染可能具有直接作用，并且個(gè)體對(duì)大腸桿菌F18菌株的抗性可能與BPI基因在腸道中表達(dá)量上調(diào)有關(guān)。
　　 3.分析BPI基因第10外顯子HpaⅡ酶切位點(diǎn)3種基因型在空腸和十二指腸中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA基因型在空腸和十二指腸中的表達(dá)量要顯著高于BB和AB基因型的表達(dá)量(P＜0.05

9、)。因此，進(jìn)一步推測BPI基因AA基因型對(duì)抗大腸桿菌F18菌株引起的斷奶仔豬腹瀉與水腫病具有直接的作用，個(gè)體對(duì)大腸桿菌F18菌株的抗性與BPI基因在腸道中表達(dá)量上調(diào)有關(guān)。豬BPI基因外顯子10HpaⅡ酶切位點(diǎn)AA基因型有望作為抗大腸桿菌F18菌株的遺傳標(biāo)記，用于抗大腸桿菌F18菌株等革蘭氏陰性菌病的育種實(shí)踐。
　　 4.蘇太豬中BPI基因外顯子10HpaⅡ酶切位點(diǎn)多態(tài)性與部分免疫指標(biāo)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AA基因型個(gè)體IL-12水平

10、顯著低于AB基因型個(gè)體(P＜0.05)，也低于BB基因型個(gè)體，但是差異不顯著(P＞0.05)，其他細(xì)胞因子的水平在3種基因型間差異不顯著(P＞0.05)，初步推斷AA基因型個(gè)體可能具有較強(qiáng)的免疫應(yīng)答能力，至少對(duì)于一般抗病力沒有不利影響，利用其作為抗大腸桿菌F18的分子標(biāo)記進(jìn)行抗病育種具有可行性。
　　 5.為了在體外研究BPI蛋白表達(dá)情況及其抑菌功能，本研究成功構(gòu)建了酵母表達(dá)載體、原核表達(dá)載體和哺乳動(dòng)物表達(dá)載體。通過對(duì)表達(dá)條件的

11、優(yōu)化，酵母表達(dá)載體和原核表達(dá)載體均未能在表達(dá)菌株中檢測到重組蛋白的表達(dá)，這可能是由于BPI蛋白強(qiáng)烈的抑菌作用造成的。最終在293-6E細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測到BPI重組蛋白的表達(dá)，并對(duì)BPI重組蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)BPI的理化性質(zhì)、蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)都和預(yù)定結(jié)果一致。此外，還發(fā)現(xiàn)豬BPI分子可能是由胞外區(qū)(35-485aa)、跨膜區(qū)(12-34aa)和胞內(nèi)區(qū)(1-11aa)3部分組成。BPI屬于分泌蛋白，主要在線粒體(44.4％)