食品有害微生物檢測(cè)與控制10大腸桿菌

1、食品有害微生物檢測(cè)與控制(10),食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),大腸菌群的食品衛(wèi)生學(xué)意義,作為糞便污染食品的指標(biāo)菌，MPN值愈低則說明食品受糞便污染程度及對(duì)人體健康危害程度愈低作為腸道致病菌污染食品的指針，大腸菌群數(shù)量越多則腸道致病菌存在的可能性就越高，但兩者之間并不總是呈平行關(guān)系要求食品中大腸菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),1982年美國 食物中毒；,我國：1997年在一定范圍內(nèi)開展監(jiān)測(cè)，已陸續(xù)

2、有十余個(gè)省份在市售食品、進(jìn)口食品、腹瀉病患者、家畜家禽等分離到該菌，并在1999年我國蘇皖毗鄰地區(qū)突然暴發(fā)了腸出血性大腸桿菌O157:H7，,GB4789.3-2010 大腸菌群測(cè)定,定義：Coliforms，一群在36℃培養(yǎng)48h可發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸 產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌。該菌主要來 源自人畜糞便，作為糞便 污染指標(biāo)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生 狀況，推斷食品中腸道致 病菌污染的可能。,食品中大腸桿菌

3、的檢驗(yàn),大腸桿菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)普遍存在的細(xì)菌，是糞便中的主要菌種。一般生活在人大腸中并不致病，但它侵入人體一些部位時(shí)，可引起感染 。,大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個(gè)或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。一般認(rèn)為可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。,總大腸菌群系指一群在37℃培養(yǎng)24小時(shí)能發(fā)酵乳酸、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、

4、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。,耐熱大腸菌群即糞大腸菌群，作為一種衛(wèi)生指標(biāo)菌，耐熱大腸菌群中很可能含有糞源微生物，因此耐熱大腸菌群的存在表明可能受到了糞便污染，可能存在大腸桿菌。但是，耐熱大腸菌群的存在并不代表對(duì)人有什么直接的危害。,致病性大腸桿菌能引起食物中毒。致病性菌株能侵入腸粘膜上皮細(xì)胞，具有痢疾桿菌樣致病力。腸致病性大腸桿菌（EPEC）、腸毒素性大腸桿菌（ETEC）和腸侵襲性大腸桿菌（EIEC）等。,O157:H7（EH

5、EC)腸出血性大腸桿菌，感染性腹瀉是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害嚴(yán)重的腸道傳染病，已逐漸成為威脅人群健康的重要公共衛(wèi)生問題。,,,,,,大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌的從屬關(guān)系,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Company Logo,概述,生物學(xué)特性 1) 形態(tài)與染色 2) 培養(yǎng)特性 3) 生化特性 4）抵抗力 5）致病性 1) 形態(tài)與染色 G－、有鞭毛、無芽孢或有莢膜，兩端鈍圓短桿菌。大小為(1.1－1.5) &

6、#181;m X (2.0－ 6.0) µm (活菌)或(0.4－0.7) µm X(1.0－3.0) µm (染色菌)，絕大多數(shù)菌株有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)，周身還有菌毛，無芽孢，某些菌株具有莢膜。,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Company Logo,概述,2) 培養(yǎng)特性 在普通培養(yǎng)基上：長成2－3mm的S型小菌落； 在鮮血瓊脂平板上:生長，有些菌株可見β型溶血環(huán)**； 在麥康凱培養(yǎng)基上:因發(fā)酵乳

7、糖而產(chǎn)生有色菌落 在SS培養(yǎng)基上:大腸桿菌一般不能生長，少數(shù)生長的菌落也因發(fā)酵乳糖而呈紅色； 在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上:生長成紫黑色帶有金屬光澤的菌落； 在液體培養(yǎng)基中:呈均勻混濁生長，形成莢膜，管底有粘性沉淀培養(yǎng)物呈特殊的臭味。,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Company Logo,概述,3) 生化特性 大腸埃希氏菌發(fā)酵多種糖 ：葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、山梨醇和丙三醇等；大部分菌株可迅速發(fā)酵乳

8、糖，各菌株對(duì)蔗糖、水楊苷、衛(wèi)矛醇及棉子糖的發(fā)酵力不一致，吲哚 ＋， MR ＋，V－P －，枸櫞酸胺鹽 －(I M V C + + - -)，尿素酶 －，硫化氫 －，氰化鉀培養(yǎng)基不中生長，丙二酸鹽利用－，可使谷氨酸和賴氨酸脫羧基，苯丙氨酸－，氧化酶－，接觸媒＋。,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),3 致病性 (1)致病因素：①侵襲力 ②內(nèi)毒素 ③腸毒素 ①侵襲力 大腸桿菌具有K抗原和菌毛： K抗原：有抗吞噬作

9、用，有抵抗抗體和補(bǔ)體的作用 菌毛：能幫助細(xì)菌粘附于粘膜表面。有侵襲力的菌株可以侵犯腸道表皮層引起炎癥。 ②內(nèi)毒素 大腸桿菌細(xì)胞壁具有內(nèi)毒素的活性： 其脂類A是毒性部位 特異多糖有助于細(xì)菌抵抗宿主的防御機(jī)制。,Company Logo,概述,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Company Logo,概述,③腸毒素 大腸埃希氏菌腸毒素有兩種： a.不耐熱腸毒素(LT)：

10、蛋白質(zhì)，加熱65℃經(jīng)30min即被破壞， 促進(jìn)腸粘膜細(xì)胞大量分泌腸液,引起腹瀉； 生食 b.耐熱腸毒素(ST)，ST無免疫性，耐熱，100℃經(jīng)10-20min不被破壞，它也可引起腹瀉。,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Company Logo,概述,(2)所致疾病 ①腸外感染 ①腸外感染 泌尿系統(tǒng)感染 敗血癥 膽囊炎

11、 肺炎 新生兒或嬰兒腦膜炎等。,Company Logo,概述,②腹瀉 4 種大腸桿菌都可引起腹瀉： 產(chǎn)毒素大腸桿菌--是嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要原因； 致病性大腸桿菌--是嬰兒腹瀉的主要原因，嚴(yán)重者可致死； 侵襲性大腸桿菌--主要引起較大兒童和成年人腹瀉，有時(shí)甚至可引起爆發(fā)流行； 出血性大腸埃希氏菌 O157--引起的主要臨床癥狀是腹瀉(重者水樣腹瀉

12、)、腹痛、嘔吐，是老幼患者死亡的主要原因。,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Company Logo,第一法：MPN法第二法： VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法第三法：Petrifilm測(cè)試片法,大腸菌群計(jì)數(shù)檢驗(yàn)流程,,,,,,,0,將產(chǎn)氣的試管內(nèi)樣品接種到BGLB肉湯,LST不產(chǎn)氣（-）?小導(dǎo)管里無氣泡,?LST產(chǎn)氣（+）,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),MPN法,第二法 VRBA平板計(jì)數(shù)法,,,,,,,選擇15~150平板計(jì)數(shù)

13、典型和可疑菌落,36℃±1 ℃ 18h ~24h,挑選10個(gè)菌落接種到BGLB,典型菌落為紫紅色周圍有紅色膽鹽沉淀環(huán)，0.5mm,,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),MPN法,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),MPN法,大腸桿菌計(jì)數(shù)MPN法檢驗(yàn)程序,檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì),,10倍稀釋,,選擇3個(gè)連續(xù)稀釋度樣品勻液接種LST,,48±2h,36℃±1℃,不產(chǎn)氣,產(chǎn)氣,,,,EC肉湯,,45℃±0.2℃

14、,24±2h,,,不產(chǎn)氣,產(chǎn)氣,,,EMB瓊脂平板,,36℃±1℃,24±2h,,營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng),,生化試驗(yàn)，革蘭染色,,查MPN表，報(bào)告,,,,如何報(bào)告結(jié)果？,根據(jù)經(jīng)確證后的對(duì)應(yīng)濃度陽性管數(shù)查MPN表MPN：最可能數(shù)，基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),MPN法,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),美國食品藥品管理局（FDA）：Bacteriological Analytical Manual ，

15、2002，Chapter 4： Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria 原理：由于96%的大腸桿菌都具有葡萄糖醛苷酸酶，能分解β-D葡萄糖醛苷，而使4-甲基傘形酮游離出來，在366nm紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光。觀察到藍(lán)色熒光即可認(rèn)為是大腸桿菌陽性。 4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷（MUG）對(duì)大腸桿菌的生長繁殖既沒有抑制作用也沒有促進(jìn)作用，對(duì)菌落形態(tài)也沒有影響。

16、,Company Logo,VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法,第二法 VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Company Logo,VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法,VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序,檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì),10倍系列稀釋,選擇2~3個(gè)適宜稀釋度的樣液，接種VRBA-MUG平板,紫外光下，計(jì)數(shù)發(fā)熒光的菌落,報(bào)告結(jié)果,,,,,36℃±1℃,18~24h,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),由希華

17、,徐標(biāo),李恒慶,宗雪梅.熒光法快速測(cè)定水中糞大腸菌群[J/OL].中國環(huán)境監(jiān)測(cè),2019(02):1-5[2019-05-10].https://doi.org/10.19316/j.issn.1002-6002.2019.02.13.,Company Logo,VRBA-MUG平板計(jì)數(shù)法,選擇不同的地表水廢水樣品進(jìn)行熒光法與多管發(fā)酵法比對(duì)測(cè)試，討論方法適用性。,熒光法與多管發(fā)酵法結(jié)果之間有顯著的線性相,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Compa

18、ny Logo,PetrifilmTM測(cè)試片法,第三法 PetrifilmTM測(cè)試片法,PetrifilmTM大腸桿菌/大腸菌群測(cè)試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng)，含有VRB培養(yǎng)基，冷水可溶性凝膠和葡萄糖苷酶指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效果。E .coli能產(chǎn)生?-葡萄糖苷酸酶與培養(yǎng)基中的指示劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀環(huán)繞在大腸桿菌菌落周圍。表面覆蓋的膠膜，可截留發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)藍(lán)點(diǎn)帶氣泡的菌落即為大腸桿菌數(shù)，紅點(diǎn)帶氣泡

19、和藍(lán)點(diǎn)帶氣泡的菌落之和為大腸菌群數(shù)。,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Company Logo,PetrifilmTM測(cè)試片法,大腸桿菌PetrifilmTM測(cè)試片檢驗(yàn)程序,檢樣25g(ml)+225ml稀釋液，均質(zhì),10倍系列稀釋,選擇2~3個(gè)適宜稀釋度的樣液，接種PetrifilmTM大腸桿菌測(cè)試紙片,計(jì)數(shù)藍(lán)色帶氣泡菌落,報(bào)告結(jié)果,,,,36℃±1℃,24±2h或48±2h,,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Compan

20、y Logo,PetrifilmTM測(cè)試片法,史夢(mèng)雨.消毒餐飲具中大腸菌群的兩種方法比較[J].中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生,2018,33(12):76-77.,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Company Logo,PetrifilmTM測(cè)試片法,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),Company Logo,大腸菌群控制,大腸菌群控制（冷凍飲品生產(chǎn)為例子）,人,機(jī),料,法,環(huán),食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),大腸菌群控制,“人”,①完善企業(yè)更衣消毒設(shè)施，獨(dú)立設(shè)置更衣間與消毒間

21、，更衣間安裝紫外滅菌燈、工作衣架。,②消毒間安裝洗手池、酒精噴淋器、干手器。,③車間進(jìn)入門口放鞋靴消毒池。,④嚴(yán)格規(guī)定進(jìn)入生產(chǎn)車間的人員必須清洗和消毒手，必須穿經(jīng)消毒的工作衣，更換工作鞋并在消毒池中消毒后方可進(jìn)入車間。,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),大腸菌群控制,“機(jī)”,①嚴(yán)格落實(shí)《生產(chǎn)設(shè)施、設(shè)備清洗消毒制度》，定期對(duì)生產(chǎn)設(shè)備及管道用CIP 清洗消毒或用90 ℃以上的熱水消毒，預(yù)防大腸菌群的滋生和繁殖。②一旦產(chǎn)品中檢出大腸菌群，要對(duì)生產(chǎn)設(shè)備和

22、管道進(jìn)行徹底消毒。,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),大腸菌群控制,“料”,①嚴(yán)格驗(yàn)收原輔料，重點(diǎn)查驗(yàn)大腸菌群項(xiàng)目，盡可能購買不含大腸菌群原輔料。②對(duì)原料產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中沒有檢驗(yàn)大腸菌群的進(jìn)行自檢，做到心中有數(shù)。③定期自檢生產(chǎn)用水，必要時(shí)進(jìn)行殺菌處理。④包裝袋使用前進(jìn)行紫外殺菌處理。,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),大腸菌群控制,“法”,①滅菌一定要徹底，一般溫度在90 ℃以上，滅菌15 min 以上，就能使產(chǎn)品達(dá)到無菌狀態(tài)。②注模消毒后一定要用無菌水進(jìn)行沖

23、洗，避免注模二次污染。③要避免交叉污染，嚴(yán)格區(qū)分開生區(qū)和熟區(qū)。,食品中大腸桿菌的檢驗(yàn),大腸菌群控制,“環(huán)”,①在生產(chǎn)車間安裝足夠的紫外滅菌燈，對(duì)生產(chǎn)環(huán)境定時(shí)殺菌。②生產(chǎn)車間定時(shí)通風(fēng)除濕，防止大腸菌群的滋生和繁殖。,,*1993年，Jack In The Box快餐連鎖店出售未煮熟的污染漢堡引起700多人（以兒童為主）食物中毒，并造成4人死亡。這一事件使大腸桿菌O157:H7臭名遠(yuǎn)揚(yáng)。* 2001年夏天，在大腸桿菌O157:H7

24、爆發(fā)殃及35人之后，ConAgra Foods立刻召回了懷疑受到污染的1900萬磅碎牛肉。美國疾病預(yù)防和控制中心估計(jì)，美國每年因大腸桿菌O157:H7致病總?cè)藬?shù)大約為73 000人，盡管上報(bào)的病例已有所下降。 *1998年，佐治亞州亞特蘭大水上公園發(fā)生的大腸桿菌O157:H7大爆發(fā)使得多名兒童住院。 *1996年5-8月，日本中學(xué)和幼兒園相繼發(fā)生多起大腸桿菌O157 集體 中毒事件，波及44個(gè)地區(qū)，7萬例，死亡12人.與芽菜有關(guān)

25、。,Company Logo,,,益生菌：不致病，能合成維生素B和維生素K，生產(chǎn)大腸菌素，對(duì)機(jī)體有利； 條件致病菌：在機(jī)體因內(nèi)外因素所致抵抗力下降或菌體侵入腸外組織或器官時(shí)條件下致病； 致病菌：引起腸道感染的有四類： 產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC） 出血性大腸埃希氏菌(enterohemorrhagic E.coli，EHEC) 腸道侵襲性大腸埃希氏菌(enteroinv

26、asive E.coli，EIEC) 腸道致病性大腸埃希氏菌(enteropathogenic E.coli，EPEC） 帶菌的牛和豬是傳播本菌引起食物中毒最重要原因，人的帶菌亦可污染食品，引起中毒。,Company Logo,,EMB瓊脂,主要成分：乳糖、營養(yǎng)物質(zhì)。指示劑系統(tǒng)：伊紅和美監(jiān)。原理：大腸菌群分解乳糖產(chǎn)酸，使伊紅與美藍(lán)結(jié)合而形成黑色化合物，故菌落呈黑紫色，并可產(chǎn)生金屬光澤。黑色程度與光澤產(chǎn)生情況與伊紅、美藍(lán)二者

27、的比例有關(guān)。不發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸的細(xì)菌，在堿性環(huán)境中不能使伊紅、美藍(lán)結(jié)合，因而形成無色的菌落。部分大腸菌群的菌株在EMB上可形成紅色或粉紅色的菌落。（應(yīng)注意非典型的菌落）。典型菌落：具黑色中心有光澤或無光澤的菌落。非典型的可疑菌落：粉紅色，無黑心,Company Logo,,靛基質(zhì)試驗(yàn)：甲基紅試驗(yàn)：V-P試驗(yàn)：檸檬酸鹽試驗(yàn)：,Company Logo,4、甲基紅（MR）試驗(yàn)和V-P試驗(yàn),二、常見生理生化試驗(yàn),糖（醇）類代謝

28、試驗(yàn),1、MR試驗(yàn)原理： 一些細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸可被進(jìn)一步分解為甲酸、乙酸、乳酸和琥珀酸而使培養(yǎng)基的PH值下降到4.5以下，加入甲基紅指示劑出現(xiàn)紅色反應(yīng)2、V-P試驗(yàn)原理 一些細(xì)菌分解葡萄糖為丙酮酸，進(jìn)一步脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性溶液中被空氣中的氧氧化成二乙酰丁二酮，進(jìn)而與培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中所含的精氨酸的胍基發(fā)生反應(yīng)生成紅色化合物。（試驗(yàn)結(jié)果同MR試驗(yàn)）,

29、二、常見生理生化試驗(yàn),糖（醇）類代謝試驗(yàn),V-P試驗(yàn) 方法：將待檢菌接種于葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)48h后加入甲液（6%α-萘酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液），振搖。,結(jié)果：在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性；如無紅色出現(xiàn)且于35℃4h后仍如故者即為陰性。,二、常見生理生化試驗(yàn),蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn),1、明膠液化試驗(yàn) 一些細(xì)菌可產(chǎn)生胞外酶，使明膠蛋白分解為氨基酸,而失去明膠的凝固能力。,陽性,陰性,2