豬PDK4基因啟動子的克隆及其活性分析.pdf

1、丙酮酸脫氫酶激酶4(Pyruvate Dehydrogenase kinase4,PDK4)是丙酮酸脫氫酶激酶的一個亞型,它是腺苷三磷酸酶(Adenosine triphosphatase,ATPase)家族成員之一。PDK4基因通過磷酸化丙酮酸脫氫酶復合體(Pyruvate dehydrogenase complex,PDC)抑制丙酮酸脫羧轉(zhuǎn)變成acetyl-CoA和CO2,從而在糖酵解,三羧酸循環(huán)以及ATP的形成等生理進程中發(fā)揮著重

2、要的作用。
　　 前期研究發(fā)現(xiàn),豬PDK4基因在中國地方豬種梅山豬和外來品種大白豬骨骼肌中表達差異顯著,并發(fā)現(xiàn)該基因與系水力、肌內(nèi)脂肪含量、肌肉色值等重要肉質(zhì)性狀有顯著相關(guān)。本研究擬對豬PDK4基因的啟動子區(qū)域進行進一步的研究,找到啟動子核心序列和主要的調(diào)控區(qū),進而探索PDK4基因在豬中的表達機制。實驗采用Real-time PCR方法、基因克隆、DNA測序和熒光素酶報告基因系統(tǒng)等手段,構(gòu)建豬PDK4基因5’側(cè)翼長片段及5’缺失

3、系列報告載體。利用上述載體分別轉(zhuǎn)染MEF-3T3(mouse embryonic fibroblasts cells3T3)和PK15(pig kidney cells)細胞,對不同片段的啟動子的轉(zhuǎn)錄活性進行定性分析,獲得豬PDK4基因啟動子的不同活性區(qū)域。取得了如下結(jié)果:
　　 1,利用豬GAPDH基因為內(nèi)參,通過Real-time PCR方法,采用2-△△ct方法分析熒光定量結(jié)果,并進行單因素方差分析,以探明其組織表達譜。結(jié)

4、果顯示,PDK4基因在初生榮昌豬12個組織中均有表達,該基因在各組織間的表達量存在著顯著性差異(P＜0.01),其中在小腸、腎臟組織中PDK4的表達量顯著高于其他各組織(P＜0.01),在心臟和大腦中的表達量最低。
　　 2,通過啟動子克隆、重組成功構(gòu)建了含推測的豬PDK4基因啟動子的六段5’端缺失報告基因載體:pGL3-122/+224(346bp)、pGL3-325/+224(549bp)、pGL3-504/+224(728

5、bp)、pGL3-985/+224(1209bp)、pGL3-1868/+224(2092bp)、pGL3-2680/+224(2904bp)。
　　 3,通過對豬PDK4啟動子在PK15細胞和MEF-3T3細胞中的熒光素酶活性比較,發(fā)現(xiàn)該啟動子活性在兩種細胞間差異較大,在PK15細胞中活性較強,在MEF-3T3中活性較弱。PK15細胞是PDK4基因特異性表達細胞。
　　 4,通過對轉(zhuǎn)染結(jié)果的分析和TESS軟件預測,確定

6、了啟動子核心區(qū)域并預測了可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。豬PDK4基因5’側(cè)翼區(qū)長片段具有較強的啟動子活性,-122/+224區(qū)域具有基本啟動子功能,-325/+224啟動子活性最強,可能與此區(qū)域的C/EBPβ(CCAAT/Enhancer-bindingProteinβ)等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點有關(guān)
　　 進一步研究表明-325/-122區(qū)域和-2680/-1868存在正調(diào)控元件,這可能與在此區(qū)域內(nèi)存在的Sp1(stimulatory pr