CEF感染ALV-J后2、3號(hào)染色體微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的研究.pdf

1、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)現(xiàn)在已經(jīng)被公認(rèn)為是惡性腫瘤形成的一個(gè)新機(jī)制，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注MSI在惡性腫瘤中的臨床應(yīng)用價(jià)值。自1993年在遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC)中發(fā)現(xiàn)有較高比例的MSI以來(lái)，人類對(duì)腫瘤病的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的研究已有20年的歷史。禽白血病作為雞的三大腫瘤性疾病之一，到目前為止，除本

2、實(shí)驗(yàn)室吳艷婷于2011年用MSI對(duì)該病做過(guò)早期診斷外，國(guó)內(nèi)外對(duì)雞白血病MSI的報(bào)道實(shí)屬罕見。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用J亞群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J，ALV-J)感染雞胚成纖維細(xì)胞，擴(kuò)增雞2、3號(hào)染色體上82個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記并電泳檢測(cè)，旨在發(fā)現(xiàn)發(fā)生變化的微衛(wèi)星位點(diǎn)，有助于臨床工作者通過(guò)獲取外周血、骨髓和內(nèi)臟器官等樣本，用變化位點(diǎn)的組合來(lái)對(duì)該病的發(fā)生做早期診斷，為禽病工作者的診斷提供理論依據(jù)。
　

3、　 23個(gè)無(wú)特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)雞胚的組織，一半作為對(duì)照組，另一半用于培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞(Chicken Embryo Fibroblast，CEF)。細(xì)胞接毒并培養(yǎng)7d且上清液用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked i mmunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性后，收集細(xì)胞。提取雞胚組織和細(xì)胞的DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用12％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，

4、銀染后用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，檢測(cè)接毒細(xì)胞基因組的微衛(wèi)星變化情況。
　　 試驗(yàn)結(jié)果顯示2、3號(hào)染色體上的82個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，有48個(gè)位點(diǎn)發(fā)生不同百分率的MSI，占全部微衛(wèi)星位點(diǎn)的58.54％，還有34個(gè)位點(diǎn)用12％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法沒有檢測(cè)到變化。檢測(cè)到有MSI的微衛(wèi)星位點(diǎn)，表現(xiàn)出不同的變化率，2個(gè)位點(diǎn)發(fā)生較高的MSI，ABR0579和MCW0220變化率均為30.43％。變化率在20％以上的位點(diǎn)有ABR0520、ABR

5、0569、MCW0311、LEI0223，變化率分別是26.09％，26.09％,21.74％,21.74％。
　　 雞胚成纖維細(xì)胞感染禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus，ALV)后的樣本有23/23(100.00％)表現(xiàn)出MSI。2號(hào)樣品，MSI發(fā)生率最高為26.83％，其次8號(hào)，7號(hào)，23號(hào)樣品MSI發(fā)生率分別為19.51％，10.98％，10.98％。其余樣品的MSI變化率均在在10％以下。
　　

6、 第7組樣品的ABR0520位點(diǎn)、第8組樣品的ABR0520和ADL0300位點(diǎn)、第15組樣品的ABR0587位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果表明，接毒細(xì)胞與組織DNA相比，核心序列中的部分堿基缺失或增加，導(dǎo)致微衛(wèi)星條帶的減小或增大，與PAGE得到的結(jié)果保持一致。
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)雞胚成纖維細(xì)胞感染ALV-J后2、3號(hào)染色體上存在多位點(diǎn)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。感染ALV后CEF可出現(xiàn)多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的改變，提示ALV感染CEF早期可能會(huì)整合到宿主的