大麗輪枝菌V07DF2 T-DNA插入突變體庫的構(gòu)建及表型變異突變體的篩選.pdf

1、大麗輪枝菌（VerticilliumdahliaeKleb.）是一種引起棉花、茄子等多種作物黃萎病的土傳病原真菌。目前，對(duì)該病菌致病的分子機(jī)理研究還不夠深入，病原菌與作物之閻的相互識(shí)別機(jī)制也仍然不夠明了，對(duì)該病的防治也未有顯著的成效。本研究旨在為深入解析大麗輪枝菌的分子致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　以江蘇省棉花黃萎病菌的代表菌株強(qiáng)致病力落葉型菌株V07DF2和中等致病力非落葉型菌株Bp2為對(duì)象，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法（Agrobac

2、teriumtumefaciens-mediatedtransformation，ATMT），對(duì)這兩株大麗輪枝菌，進(jìn)行了綠色熒光蛋白的標(biāo)記。將經(jīng)改造而成的熒光標(biāo)記載體1300-HYG-sGFP，通過ATMT方法將其T區(qū)整合入大麗輪枝菌基因組中，并且通過對(duì)ATMT法的修改，使最終轉(zhuǎn)化效率達(dá)到0.1％～0.2％，即106個(gè)孢子可轉(zhuǎn)化長(zhǎng)出1000～2000個(gè)轉(zhuǎn)化子。通過對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，獲得熒光表達(dá)較強(qiáng)并性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因菌株，然后接種擬南芥，

3、觀察其侵染過程。結(jié)果表明，被熒光標(biāo)記的菌株在細(xì)胞、組織層面上均可以很好的反應(yīng)不同侵染階段的特征。熒光標(biāo)記大麗輪枝菌的研究為建立穩(wěn)定的大麗輪枝菌遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為深入探尋該病原菌侵染和致病機(jī)理積累了研究材料。
　　由于T-DNA插入突變是隨機(jī)的，其中包含了大量的無意突變。啟動(dòng)子捕獲技術(shù)（promotertrap）是在T-DNA區(qū)域的邊界附近構(gòu)建一個(gè)無啟動(dòng)子的報(bào)告基因（如GFP），該元件和選擇標(biāo)記基因一起組成捕獲載體。T

4、區(qū)兩側(cè)的報(bào)告基因只要插入到受啟動(dòng)子啟動(dòng)的區(qū)域或與未知基因發(fā)生正確的融合表達(dá)，該報(bào)告基因就被激活，從而可以避免無意義的插入突變。我們?cè)谝呀?jīng)建立的ATMT方法基礎(chǔ)上，構(gòu)建雙向GFP啟動(dòng)子捕獲載體，將其轉(zhuǎn)入大麗輪枝菌V07DF2中，構(gòu)建V07DF2T-DNA插入突變體庫，共保存了6000個(gè)突變體。雙向啟動(dòng)子捕獲載體T-DNA區(qū)兩端分別含有GFP的ORF和終止子，中間有潮霉素抗性盒子和質(zhì)粒拯救元件。沒有啟動(dòng)子的GFP序列可以捕獲表達(dá)基因的啟動(dòng)子

5、，潮霉素抗性盒子用于篩選轉(zhuǎn)化子，而質(zhì)粒拯救元件有利于獲得T-DNA插入位點(diǎn)的序列片段。隨機(jī)選擇突變體，進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)分析，判斷載體各片段的功能，以保證雙向啟動(dòng)子捕獲載體的有效性。T-DNA插入突變體庫中突變體在保存前都需經(jīng)過單孢分離，以防止交叉污染，同時(shí)保證每個(gè)突變體T-DNA的穩(wěn)定整合。
　　在大麗輪枝菌V07DF2T-DNA插入突變體庫中，隨機(jī)選擇1000個(gè)突變體進(jìn)行表型分析，篩選指標(biāo)為菌落生長(zhǎng)速度、菌絲形態(tài)、產(chǎn)色素情況、產(chǎn)孢能