水稻細菌性條斑病菌中受DSF群體感應系統(tǒng)調(diào)控的外泌蛋白的功能研究.pdf

1、小分子DSF（DiffusibleSignalFactor）介導的群體感應(Quorumsensing，QS)系統(tǒng)在黃單胞菌的侵染和致病過程中具有關鍵作用，但DSF調(diào)控的外泌蛋白的種類和功能仍不清楚。由稻黃單胞菌稻生致病變種（Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc）引起的水稻細菌性條斑病是我國水稻生產(chǎn)上一種重要的細菌病害。本研究以Xoc為對象，研究受DSF調(diào)控的外泌蛋白的種類、致病功能及機制，研究結果如下:<

2、br>　　（一）本實驗室趙延存博士的前期研究中鑒定了Xoc中受DSF調(diào)控的53個外泌蛋白（趙延存論文，2011）。本研究選取了其中15個感興趣的目標蛋白用于后續(xù)研究。這15個蛋白的功能涉及小分子蛋白介導的群體感應、細胞結構、細胞進程、氧化壓力環(huán)境的適應、中間代謝、蛋白降解以及功能未知的蛋白。采用基因定向缺失技術，對這15個蛋白的編碼基因進行敲除，獲得相應的基因缺失突變株。致病性測定顯示其中4個突變株顯著削弱了Xoc對寄主水稻的致病性，其

3、對應的蛋白/基因分別是XOC_0319（Ax21同系物，依賴XA21的水稻免疫激發(fā)子）、XOC_2128（多聚半乳糖醛酸酶）、XOC_3806（蛋白酶）和XOC_1601（半胱氨酸蛋白酶）。表型分析表明，這4個基因對Xoc的定殖能力、胞外多糖產(chǎn)量、游動性、生物膜的形成、胞外蛋白酶活性、抗氧化壓力等毒力相關表型造成了不同程度的影響。具體結果如下:這4個基因的突變沒有影響Xoc的生長速率，但影響了Xoc在水稻中接種發(fā)病后的定殖量，同時還均降

4、低了胞外多糖的產(chǎn)量。XOC_2128和XOC_1601的突變減弱了菌體游動性，XOC_0319的突變減弱了生物膜的形成，XOC3806和XOC_1601的突變減弱了胞外蛋白酶活性，XOC3806和XOC_2128的突變使Xoc的抗氧化壓力能力有所增強。熒光定量顯示這四個基因在Rs105ΔrpfF的表達水平在一定程度上取決于培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況，相關結果和Rs105ΔrpfF中差異蛋白表達情況不完全一致;同時我們還發(fā)現(xiàn)這四個基因對10個已知的

5、致病相關基因存在一定的轉錄調(diào)控作用。xpsE是Ⅱ型分泌系統(tǒng)關鍵基因，熒光定量PCR還顯示Rs105ΔrpfF中xpsE的轉錄表達水平顯著下降，說明DSF群體感應系統(tǒng)對Ⅱ型分泌系統(tǒng)的功能存在某種程度的調(diào)控作用。此外，Ax21（水稻XA21先天免疫激發(fā)子）是Xoo泌出的能在依賴XA21的水稻上激發(fā)先天免疫的硫化蛋白，并且Ax21還被認為是Xoo中一種新型群體感應的信號分子;XOC_0319就是Ax21在Xoc的同系物，本研究說明這兩種QS系

6、統(tǒng)的功能很可能存在交叉和聯(lián)系。本研究是黃單胞菌中第一次對受DSF介導的群體感應調(diào)控的外泌蛋白及其功能進行了系統(tǒng)深入分析，相關結果顯示了DSF型群體感應系統(tǒng)對Ⅱ分泌系統(tǒng)毒力因子及AX21介導的群體感應有重要的調(diào)控作用，進一步明確了Xoc中DSF型群體感應系統(tǒng)的功能。
　?。ǘ┎≡诩闹鞅砻娴酿じ叫允瞧涑晒η秩镜南葲Q條件，主要在細菌黏附、定殖等侵染早期進程中起重要作用，而這個過程是由被稱為黏性因子的蛋白質(zhì)來完成的。因此我們選擇了T

7、5SS泌出的兩個非菌毛黏性蛋白XadA、YapH進行研究，對相關基因xadA、yapH進行了缺失敲除，并對它們的致病機制及其與DSF型群體感應系統(tǒng)的關系進行了試驗和分析。XadA和YapH是通過Ⅴ型分泌系統(tǒng)泌出的兩個黏性蛋白。我們找到了xadA、yapH的同系物，即XOC3808、XOC_2467，然后構建了缺失突變體ΔxadA、yapH。致病相關表型的測定的結果顯示這兩個黏性蛋白均和Xoc的噴霧接種時的致病性、水稻葉片表面黏附性、胞外

8、多糖合成能力相關，但與非生物表面的黏附性無關。實時定量熒光PCR表明，xadA、yapH的在模擬植物汁液的培養(yǎng)條件下的轉錄表達水平的變化存在差異，其中yapH能夠被這種培養(yǎng)基誘導表達;xadA、yapH的轉錄表達受DSF型群體感應通路調(diào)控的模式不同，其中yapH受rpfF、clp正向調(diào)控，xadA受rpfF、clp負向調(diào)控，說明DSF群體感應系統(tǒng)很可能與外泌黏性蛋白功能的發(fā)揮密切相關。本研究首次為XadA、YapH在Xoc致病過程中的作