小麥韌皮部篩分子程序性細胞半死亡中的BEN1-LIKE蛋白和Zn2+的定位與功能初探.pdf

1、小麥（TriticumaestivumL.）穎果韌皮部篩分子(Sieve elements，SEs)的主要功能是運輸營養(yǎng)物質(zhì)。已有研究證明，小麥穎果韌皮部篩分子發(fā)育時間在0～7DAF，期間經(jīng)歷了一個獨特的細胞程序性死亡過程——細胞程序性半死亡，即該程序性死亡由于多種原因中途停滯，并沒有進行到底。其發(fā)育過程中細胞器和細胞質(zhì)發(fā)生有序降解，但成熟篩分子仍保留少量細胞質(zhì)和完整細胞質(zhì)膜，仍有活性和執(zhí)行養(yǎng)分運輸功能。目前，關于篩分子細胞程序性半死亡

2、的研究報道較少，其發(fā)育機理還有許多未知的方面。例如，篩分子發(fā)育時細胞核會發(fā)生降解，但細胞核降解過程是如何調(diào)控的？是否有某些蛋白酶參與了核降解的調(diào)控過程？這些蛋白酶的活性和相關基因的表達是否與細胞程序性死亡中止有關？為了解決上述問題，本次實驗研究采用顯微和超微免疫組織化學定位法、原位雜交定位法和多種分子生物學技術，研究了小麥穎果韌皮部篩分子發(fā)育過程中BEN1-LIKE（大麥核酸內(nèi)切酶）蛋白和Zn2+的定位，并對Ⅱ型Metacaspase（

3、半胱氨酸蛋白酶）基因和caspase-3-like（半胱天冬酶-3）蛋白進行了初步檢測，得到了如下主要結(jié)論:
　　1、在篩分子發(fā)育過程中，細胞核降解主要發(fā)生在2～5DAF。3DAF，細胞核開始發(fā)生明顯變形內(nèi)陷。4DAF，細胞核裂解的殘留物質(zhì)被液泡吞噬降解。在5DAF，細胞核基本被完全降解;液泡膜局部與細胞質(zhì)膜發(fā)生膜融合，融合區(qū)間包含了部分細胞內(nèi)含物。
　　2、小麥穎果腹部維管束組織DNA凝膠電泳結(jié)果顯示出DNAladder現(xiàn)

4、象，為PCD的典型特征。熒光定量PCR顯示，小麥穎果腹部維管束組織中兩個Ⅱ型Metacaspase基因（TeaMCAⅡ和TaMCA4）有超表達，且有相似的表達趨勢，即均在1～6DAF達到最高。Caspase-3-like蛋白的免疫組化檢測結(jié)果顯示，1DAF和2DAF的小麥篩分子中陽性信號較3～7DAF的明顯增強。
　　3、熒光定量PCR顯示，BEN1-LIKE基因也在小麥腹部組織中有超表達，且在3DAF達到最高;通過免疫組織化學法

5、檢測，發(fā)現(xiàn)在顯微細胞水平上BEN1-LIKE蛋白主要定位在3DAF和4DAF的韌皮部篩分子中。另外，mRNA原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)，在3DAF和4DAF，BEN1-LIKE的mRNA轉(zhuǎn)錄信號最明顯。免疫電鏡檢測進一步在超微亞細胞水平上發(fā)現(xiàn)BEN1-LIKE蛋白主要定位在篩分子細胞核上。
　　4、TSQ-Zn2+熒光探針檢測發(fā)現(xiàn)，反映篩分子Zn2+濃度的藍色熒光信號在3DAF和4DAF時比2DAF和5DAF要強，表明篩分子內(nèi)源Zn2+的濃

6、度先增加后減少，該變化趨勢與BEN1-LIKE蛋白的變化有高度的的關聯(lián)性。
　　綜上所述，在篩分子發(fā)育過程中檢測到Ⅱ型Metacaspase基因（TeaMCAⅡ和TaMCA4）的表達以及caspase-3-like蛋白的定位，推測它們可能在篩分子的分化發(fā)育初期起作用。根據(jù)BEN1-LIKE蛋白的動態(tài)變化與細胞核降解的時間推測，BEN1-LIKE蛋白可能參與了篩分子發(fā)育過程中細胞核的降解。另外，由于篩分子內(nèi)源Zn2+的濃度變化與BE