偽狂犬病毒編碼的microRNAs功能研究.pdf

1、偽狂犬病毒(PRV)是α皰疹病毒亞科的重要成員之一，具有嗜神經(jīng)性和潛伏感染性，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在偽狂犬病毒的急性感染期或者裂解感染期，被膜蛋白VP16通過(guò)與宿主的細(xì)胞因子Oct-1和HCF-1結(jié)合從而激活立即早期基因IE180的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控一系列下游基因的表達(dá)和病毒的增殖。主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(lèi)分子(MHCⅠ)可以識(shí)別和遞呈病毒編碼的內(nèi)源性蛋白，發(fā)揮抗病毒免疫作用。
　　病毒編碼的microRNA(miRNA

2、)在病毒生命周期中參與調(diào)控病毒基因的表達(dá)和病毒的增殖，也可以調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡、代謝和免疫。先前，我們實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了PRV的長(zhǎng)潛伏感染相關(guān)基因(LLT)可以編碼11個(gè)成熟的miRNAs，但是這些miRNAs的具體功能還不清楚。本研究選擇了病毒復(fù)制關(guān)鍵基因和宿主免疫識(shí)別基因作為研究對(duì)象，希望通過(guò)發(fā)掘作用于這些重要基因的miRNA，加深對(duì)病毒致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為開(kāi)發(fā)新的疫苗或藥物提供理論指導(dǎo)。具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.通過(guò)生物信息學(xué)軟件

3、預(yù)測(cè)篩選到prv-mir-LLT7既可以結(jié)合MHCⅠ基因的3'UTR又可以結(jié)合PRV的VP16基因的3'UTR，其中prv-mir-LLT7在VP16的3'UTR中有2個(gè)作用位點(diǎn);預(yù)測(cè)篩選到PRV編碼的prv-mir-LLT1、prv-mir-LLT7、prv-mir-LLT8、prv-mir-LLT9和prv-mir-LLT11等5個(gè)miRNRs可以作用于IE180基因。
　　2.為了驗(yàn)證MHCⅠ基因和VP16基因是否被prv-

4、mir-LLT7直接調(diào)控和確定prv-mir-LLT7作用MHCⅠ基因和VP16基因的位點(diǎn)，本研究使用雙熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)了prv-mir-LLT7既可以作用于MHCⅠ基因又可以作用于VP16基因，其中prv-mir-LLT7在VP16的3'UTR中有2個(gè)作用位點(diǎn)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和流式細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)prv-mir-LLT7可以下調(diào)MHCⅠ基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。通過(guò)qRT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)

5、現(xiàn)prv-mir-LLT7可以下調(diào)VP16的轉(zhuǎn)錄和翻譯;隨后進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)prv-mir-LLT7還能夠下調(diào)IE180的轉(zhuǎn)錄和翻譯;通過(guò)miRNA inhibitor抑制prv-mir-LLT7后，qRT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明prv-mir-LLT7 inhibitor可以抑制prv-mir-LLT7對(duì)MHCⅠ和VP16基因的調(diào)控。
　　3.我們使用qRT-PCR方法檢測(cè)PRV感染上皮細(xì)胞后的prv-mir

6、-LLT7的表達(dá)譜，分析了prv-mir-LLT7的表達(dá)與prv-mir-LLT7作用于MHCⅠ和VP16的相關(guān)性。通過(guò)一步生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示prv-mir-LLT7在細(xì)胞感染PRV后9h時(shí)候可以降低PRV增殖。
　　4.為了驗(yàn)證病毒編碼的5個(gè)miRNAs是否直接作用IE180基因，本研究使用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)和劑量依賴實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PRV編碼的prv-mir-LLT1、prv-mir-LLT9和prv-mir-

7、LLT11可以直接作用于IE180基因。通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PRV編碼的prv-mir-LLT1、prv-mir-LLT9和prv-mir-LLT11下調(diào)IE180的表達(dá)。
　　綜上所述，PRV編碼的prv-mir-LLT7可以調(diào)控豬的MHCⅠ基因和病毒的VP16基因的表達(dá)。該病毒編碼的prv-mir-LLT1、prv-mir-LLT9和prv-mir-LLT11可以下調(diào)IE180基因的表達(dá)。我們推測(cè)α皰疹病毒進(jìn)