基于高通量測(cè)序的石刁柏基因轉(zhuǎn)座子分析.pdf

1、石刁柏（AsparagusofficinalisL.）又名蘆筍、龍須菜，屬于百合科天門冬屬多年生宿根性草本植物。石刁柏是典型的雌雄異株植物，不僅可以作為研究雌雄異株植物性別決定與分化的模式植物之一，也為植物性染色體起源與進(jìn)化的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。但是，目前對(duì)于石刁柏性染色體的起源和演化性別決定機(jī)制仍未獲得直接的遺傳學(xué)證據(jù)。轉(zhuǎn)座子作為一種可移動(dòng)的遺傳因子廣泛存在于植物基因組中，是造成染色體不穩(wěn)定的重要因素之一，有可能是植物性染色體演

2、化的啟動(dòng)器和推進(jìn)器。因此，對(duì)于石刁柏基因組中轉(zhuǎn)座子的全面分析有助于獲得其性染色體起源及性別決定的早期線索。
　　基于此，本文以石刁柏為材料，在利用高通量測(cè)序技術(shù)獲得的雌、雄基因組高通量序列的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)基因組中的轉(zhuǎn)座子類型、分布及拷貝數(shù)等特征進(jìn)行了分析。同時(shí)，對(duì)兩個(gè)scaffolds序列進(jìn)行了序列擴(kuò)增克隆及鑒定，分析了序列結(jié)構(gòu)特征及和同屬近緣種間的序列變異分析，并對(duì)石刁柏的不同品種、不同單株、不同性別、不同單克隆及

3、近緣種之間的異質(zhì)性進(jìn)行了比較分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.基于高通量測(cè)序技術(shù)，共獲得了17Gb的基因組序列，測(cè)序深度為12×，通過(guò)序列組裝獲得總計(jì)長(zhǎng)約400Mbp的163406個(gè)scaffolds，占石刁柏基因組的30％，其中轉(zhuǎn)座子占石刁柏組裝序列的53％，在總的轉(zhuǎn)座子序列中LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子比例最大，占到總基因組的28％。在反轉(zhuǎn)座子中，Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的拷貝數(shù)要明顯高于Ty3-gypsy類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。另外，

4、通過(guò)對(duì)雌、雄基因組中轉(zhuǎn)座子的比較結(jié)果表明，幾乎所有的轉(zhuǎn)座子類型在雌、雄基因組中都是高度相似的，包括反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子類型中的Ty3-gypsy、LINE和SINE，以及DNA轉(zhuǎn)座子類型中的Ac/Ds、MULE、Mariner和ping/pong/SNOOPY，它們各占雌、雄基因組的百分比差異范圍為0～0.261％;僅有個(gè)別的轉(zhuǎn)座子類型中存在有微小的差別，包括反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子類型中的Ty1-copia和DNA轉(zhuǎn)座子類型中的CACTA，兩者分別在雌、

5、雄基因組中的比例差異為1.99％和0.50％。這一結(jié)果與石刁柏性染色體起源較晚是一致的。
　　2.通過(guò)NCBI中Blastp對(duì)獲得的石刁柏的109條序列進(jìn)行序列特征搜索發(fā)現(xiàn)，109條序列均為Ty1-copia類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，其中，scaffold101366的52條序列中有25條序列為Ty1-copia逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)，有11條序列為RNA酶保守區(qū)，有17條序列既為Ty1-copia逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)，又為RNA酶保守區(qū);scaffol

6、d107518的57條序列中有36條序列為Ty1-copia逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)，有6條序列為RNA酶保守區(qū)，有15條序列既為Ty1-copia逆轉(zhuǎn)錄酶保守區(qū)，又為RNA酶保守區(qū)。因此，進(jìn)一步證明所獲得的兩個(gè)scaffold序列是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列。
　　3.根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)序列scaffold101366和scaffold107518的PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，在所擴(kuò)增的109條序列中序列和測(cè)序結(jié)果一致性均達(dá)到95％以上。獲得的scaffold

7、101366的序列共55條，經(jīng)多序列比對(duì)結(jié)果顯示，石刁柏的52條序列一致性為92.44％。對(duì)突變位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)共有326處位點(diǎn)發(fā)生了突變，其中發(fā)生了2082次堿基轉(zhuǎn)換，占?jí)A基置換的80％，其中，T(→)C占51.28％，G(→)A占48.72％;508次堿基顛換(T(→)A，A(→)C，T(→)G，C(→)G)。而獲得的scaffold107518的序列共有59條，多序列比對(duì)結(jié)果表明，石刁柏的57條序列的一致性為92.13％。突變位點(diǎn)分

8、析結(jié)果表明，有227處突變位點(diǎn)，堿基轉(zhuǎn)換發(fā)生了3039次，占?jí)A基置換的80％，其中，T(→)C占50.89％，G(→)A占49.11％;堿基顛換發(fā)生了760次。由以上結(jié)果說(shuō)明，在所分析的兩個(gè)石刁柏Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子其異質(zhì)性的產(chǎn)生主要是由于堿基轉(zhuǎn)換造成的。
　　4.利用MEGA軟件對(duì)scaffold101366的55條序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)表明，兩個(gè)石刁柏品種(TD818和UC309)中的Ty1-copia序列可以聚為兩個(gè)大組

9、GroupⅠ和GroupⅡ，但是，通過(guò)對(duì)兩組序列的分析發(fā)現(xiàn)序列聚類未表現(xiàn)出性別和品種的特異性;而且，和其近緣種文竹的序列相比種內(nèi)異質(zhì)性大于種間異質(zhì)性。scaffold107518的59條序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果也表明，該轉(zhuǎn)座子在石刁柏品種間、性別間均未表現(xiàn)出特異性且石刁柏的兩個(gè)品種中的Ty1-copia序列均與文竹中的Ty1-copia序列無(wú)明顯差異。由此說(shuō)明，Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在石刁柏的不同品種、不同性別、不同單克隆及近緣種中