石刁柏Ty1-copia類反轉(zhuǎn)座子Aocrt4的克隆與分析.pdf

1、石刁柏是一種常見的雌雄異株植物，染色體組成為2n=20，具有一對(duì)處于進(jìn)化初期的同型性染色體XY，但是，至今尚未獲得確切的核型及同型性染色體直接的細(xì)胞學(xué)證據(jù)。石刁柏的染色體組具有不穩(wěn)定性特征。主要表現(xiàn)在，存在異型的常染色體對(duì)，B染色體數(shù)目不固定以及不同品種間的核型在著絲點(diǎn)位置和隨體位置方面有差異。故，石刁柏既是研究性染色體進(jìn)化、兩性植物起源和植物性別決定機(jī)制的模式植物，也是研究植物基因組和染色體組穩(wěn)定性的良好材料。
　　反轉(zhuǎn)座子是可

2、以在染色體間移動(dòng)的DNA片段，其活動(dòng)與基因組和染色體組的穩(wěn)定性、基因的表達(dá)、染色質(zhì)重塑等細(xì)胞學(xué)行為之間具有高度的相關(guān)性。
　　鑒于此，本文以石刁柏及其同屬的文竹為材料，利用PCR、RT-PCR、染色體原位雜交等技術(shù)，通過相關(guān)生物信息學(xué)的分析，對(duì)獲得的一個(gè)石刁柏反轉(zhuǎn)座子的序列特征、拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄活性及染色體定位進(jìn)行了研究，并對(duì)其在石刁柏染色體組進(jìn)化中的作用進(jìn)行了探討，為石刁柏染色體組的進(jìn)化提供基礎(chǔ)資料。主要研究結(jié)果如下:
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3、、以石刁柏和文竹為材料，利用兼并引物對(duì)Ty1-copia反轉(zhuǎn)座子進(jìn)行克隆和分析。結(jié)果顯示，從石刁柏及文竹基因組中均獲得了長約260bp的預(yù)期條帶。測(cè)序及序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列屬于Ty1-copia類反轉(zhuǎn)座子的反轉(zhuǎn)錄酶基因保守區(qū)序列。
　　2、利用RT-PCR技術(shù)對(duì)Aocrt4及Ascrt1的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，Aocrt4及Ascrt1在石刁柏雌雄轉(zhuǎn)錄組中均擴(kuò)增出陽性條帶，并且Aocrt4條帶的相對(duì)亮度在雌、雄石刁柏間無明顯

4、差別，說明該反轉(zhuǎn)座子仍具有轉(zhuǎn)錄活性，且雌雄性別間的轉(zhuǎn)錄活性沒有差異。結(jié)合高通量測(cè)序結(jié)果，對(duì)Aocrt4的拷貝數(shù)進(jìn)行估計(jì)發(fā)現(xiàn)，Aocrt4在石刁柏雌、雄基因組中的總拷貝數(shù)分別為2996和4572，每1C的拷貝數(shù)分別是558和589，這說明該反轉(zhuǎn)座子的分布與性別沒有明顯相關(guān)性。
　　3.為了分析Aocrt4是否具有種內(nèi)異質(zhì)性，本研究分別選擇石刁柏雌、雄各3株及文竹1株，用特異引物分別對(duì)這7個(gè)目標(biāo)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物隨機(jī)挑選8

5、個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總共獲得的48個(gè)序列長度分布在244-245bp之間，平均相似度為97.72％，表現(xiàn)出較低的異質(zhì)性。雌雄間和同性別的不同株間序列的相似度沒有顯著的差異。通過對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在48個(gè)序列中共有266個(gè)突變位點(diǎn)，除兩個(gè)位點(diǎn)是單堿基缺失外，其余均為堿基置換，且多為G/C(→)A/T。對(duì)石刁柏和文竹中的該反轉(zhuǎn)座子序列比較，發(fā)現(xiàn)其種間異質(zhì)性高于種內(nèi)異質(zhì)性。通過Aocrt4的氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列共編碼8

6、3個(gè)氨基酸，有12個(gè)序列發(fā)生了終止密碼子突變，突變位點(diǎn)集中在第47和48個(gè)氨基酸位置;2個(gè)氨基酸序列發(fā)生了移碼突變;在第43、49和73個(gè)氨基酸位置都分別存在兩種氨基酸，依次分別是組氨酸(H)/酪氨酸(Y)，組氨酸占85.2％;纈氨酸(V)/異亮氨酸(I)，纈氨酸占72.8％;異亮氨酸/蘇氨酸(T)，異亮氨酸占93.8％。除此之外，所有的氨基酸序列表現(xiàn)出了高度的保守性。
　　4、利用染色體原位雜交技術(shù)對(duì)Aocrt4進(jìn)行定位。結(jié)果發(fā)