家蠶新突變體紫色類鶉斑q-lp的定位分析.pdf

1、表皮是家蠶最重要的器官之一，幼蟲期隨著每次入眠而更換，對蠶體具有保護(hù)作用。斑紋是表皮的重要特征，其形態(tài)、色彩、濃淡等性狀極富多樣性，斑紋的研究對于色素代謝及斑紋形成機理的研究具有重要的理論意義。
　　家蠶紫色類鶉斑突變體(q-lp)是在家蠶飼養(yǎng)過程中，從素蠶品種932VR中發(fā)現(xiàn)的一種新的突變體，該突變體整體斑紋與鶉斑(q)極其相似，體色為淺粉紫色，幼蟲雖然能正常發(fā)育，但是食桑量少，發(fā)育緩慢，體質(zhì)較弱，體型較小，繭型偏小。
　

2、　遺傳分析表明，該突變性狀是由一個隱性基因q-lp控制的，經(jīng)過形態(tài)標(biāo)記檢測和SSR標(biāo)記多態(tài)性分析，該基因位于家蠶第8連鎖群。在此基礎(chǔ)上利用圖位克隆技術(shù)對突變基因進(jìn)行精細(xì)定位，從基因測序和表達(dá)兩個方面對定位區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行篩選，以期找到引起突變性狀發(fā)生的突變基因，分析該基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)，為后期研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下：
　　1、在第8連鎖群篩選SSR多態(tài)性分子標(biāo)記，對q-lp進(jìn)行精細(xì)定位，最終將q-lp定位到分子標(biāo)

3、記nscaf2828-109和nscaf2828-063之間，兩標(biāo)記之間相距0.98 cM，物理距離為257kb，根據(jù)silk DB數(shù)據(jù)庫，范圍內(nèi)有14個預(yù)測基因。
　　2、以野生型和突變型4齡眠蠶表皮為材料進(jìn)行半定量分析，14個預(yù)測基因均無明顯差異，進(jìn)一步以蟻蠶為材料進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)突變體中BGIBMGA005421-TA和 BGIBMGA005422-TA表達(dá)量較野生型略微偏低。BGIBMGA005421-TA和BGIBM

4、GA005422-TA在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫Silk DB和KAIKObase中有著不同的注釋，Silk DB中標(biāo)注BGIBMGA005421-TA和BGIBMGA005422-TA兩個基因，而在 KAIKObase數(shù)據(jù)庫中，只標(biāo)注一個基因，該基因的功能注釋為Orcokinin基因（簡寫Ork）。Ork基因包括BGIBMGA005421-TA基因5’ UTR和第1、2個外顯子的序列以及BGIBMGA005422-TA基因第1個外顯子3’端部

5、分序列和第2、3、4個外顯子的全部序列?；蚩寺嶒炞C明了BGIBMGA005421-TA、BGIBMGA005422-TA及Ork的轉(zhuǎn)錄本同時存在。
　　對這3個基因的ORF和基因組進(jìn)行克隆測序，BGIBMGA005422-TA基因在突變體和野生型之間不存在序列差異；而 BGIBMGA005421-TA基因在突變型中第2個外顯子上缺失了一個單堿基C；Ork第2個外顯子與BGIBMGA005421-TA基因相同位點存在單堿基缺失突

6、變。
　　3、野生型BGIBMGA005421-TA基因cDNA全長為1099bp，其中5’UTR67 bp，ORF864bp，3’ UTR168 bp，Poly A28 bp。在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫Silk DB進(jìn)行Blast，發(fā)現(xiàn)其5’ UTR部分序列與第1個外顯子相距6kb左右；在轉(zhuǎn)錄起始位點上游20-30 bp的位置發(fā)現(xiàn)該基因的啟動子核心元件TATABox。通過Q-PCR對BGIBMGA005421-TA基因進(jìn)行組織表達(dá)譜和各

7、發(fā)育時期表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)其在脂肪體中表達(dá)量最高，在表皮、中腸和氣管中表達(dá)量也較高；在幼蟲期各齡期中盛食期相比其他時期表達(dá)量偏高，大蠶期相比小蠶期表達(dá)量偏高，將熟蠶表達(dá)量達(dá)到最大。
　　4、單堿基缺失導(dǎo)致BGIBMGA005421-TA和Ork基因翻譯提前終止，可能是突變體產(chǎn)生的主要原因。在野生型家蠶的二齡將眠蠶中進(jìn)行BGIBMGA005421-TA基因的RNAi實驗，發(fā)現(xiàn)該基因的沉默可增加家蠶皮膚黑斑，初步說明該基因與紫色類鶉斑表