25300.黑曲霉α葡萄糖苷酶的基因克隆表達(dá)與定性

1、得的研究成果盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含本人為獲得江南大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。6乏簽名：盎麥壺日期：趁坦。!』。鏨關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本學(xué)位論文作者完全了解江南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定：江南大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查

2、閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、；12編學(xué)位論文，并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相一致。保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。簽名：隱壺2c2導(dǎo)師簽名：日期：—————』三_一／／／II／I／I／／#WII／／g。g聊HI／I／E／IIlIH3N／IH摘要a葡萄糖苷酶(EC32120)，又名aD葡萄糖苷水解酶，可以催化水解低聚糖類(lèi)生成葡萄糖，其在自然界中廣泛分

3、布，性質(zhì)各異。來(lái)源于黑曲霉(Aspergillusniger)的a葡萄糖苷酶不僅具有水解活性，還具有轉(zhuǎn)苷能力。當(dāng)Anigera葡萄糖苷酶作用于麥芽糖時(shí)，能夠切割開(kāi)麥芽糖的a1，4糖苷鍵，將游離出來(lái)的葡萄糖殘基以ft1，6形式轉(zhuǎn)移到其他糖底物上，形成具有非發(fā)酵性的功能性低聚糖——低聚異麥芽糖(簡(jiǎn)稱(chēng)IMOs，主要包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等)，因此在工業(yè)上廣泛應(yīng)用于IMOs的生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作中，通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增得到4n／g

4、e，SGl36的0t葡萄糖苷酶cDNA，并在畢赤酵母(Pichapastoris)中表達(dá)，但是所獲得的重組酶生化活性較低。本研究以彳nigerCICIMF0620的總RNA為模板，通過(guò)RTPCR獲得a葡萄糖苷酶eDNA，并在只pastorisKM71中表達(dá)，同時(shí)對(duì)重組Ppastoris生產(chǎn)a葡萄糖苷酶的發(fā)酵工藝和重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下：(1)以AnigerCICIMF0620的總RNA為模板，通過(guò)RTPCR擴(kuò)增得到全

5、長(zhǎng)為2883bp的a葡萄糖苷酶eDNA。將該eDNA克隆到只pastoris表達(dá)載體pPIC9K上，BglII酶切線性化后電轉(zhuǎn)入戶pastoris菌株KM71，經(jīng)過(guò)MD、YPD／G418平板篩選，獲得重組菌株KM71／pPIC9Kagtu。搖瓶發(fā)酵條件下誘導(dǎo)120h，重組菌發(fā)酵上清液中的pNPG水解酶活為044U／mL。(2)考察基因工程茵KM71／pPIC9Kaglu的搖瓶發(fā)酵情況，確定適宜的發(fā)酵條件為：誘導(dǎo)階段初始菌濃OD600為5

6、0，誘導(dǎo)pH5，誘導(dǎo)溫度280C，每24h添加15％(v／v)醇，誘導(dǎo)表達(dá)周期120h，酶活可達(dá)到115U／mL，是原始野生菌產(chǎn)酶量的182倍。(3)在3L發(fā)酵罐上，通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)起始菌濃和起始甲醇添加量，KM71／pPIC9Kagtu誘導(dǎo)96h后發(fā)酵上清液的pNPG水解酶活達(dá)351U／mL，蛋白含量為1759I_tg／mL。其酶活和蛋白含量分別是搖瓶水平的30和34倍。在30L罐上進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)，終酶活達(dá)到512U／mL，表達(dá)量為現(xiàn)有報(bào)

7、道中的最高水平。(4)將重組酵母的發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)3kDa超濾膜濃縮、乙醇沉淀、疏水柱層析后得到純化的重組a一葡萄糖苷酶。重組0【葡萄糖苷酶在溶液中以二聚體形式存在。SDSPACE電泳表明，重組酶的分子量為145kDa，經(jīng)去糖基化酶EndoHf處理后，分子量減少至115kDa，證明重組酶在只pastoris表達(dá)系統(tǒng)中受到糖基化修飾。重組0【葡萄糖苷酶的最適溫度為600C，在500C具有良好的熱穩(wěn)定性；最適pH為45，pH穩(wěn)定范圍為pH30

8、70。在500C，pH45，以硝PG為底物，‰和‰觚分別為045mM和4348U／mg。大多數(shù)金屬對(duì)重組a葡萄糖苷酶的酶活性無(wú)明顯影響。(5)重組洳葡萄糖苷酶具有轉(zhuǎn)苷活性，可轉(zhuǎn)化麥芽糖生成IlViOs，轉(zhuǎn)苷能力與市售a葡萄糖苷酶相近。重組酶的最優(yōu)轉(zhuǎn)苷條件為：pH50的30％(w／v)麥芽糖溶液，加酶量O05U／g麥芽糖，600C反應(yīng)20～24h。在最優(yōu)反應(yīng)條件下，IMOs的產(chǎn)量可達(dá)18312g／L，轉(zhuǎn)化率為60％。本研究為重組Gt葡萄糖