尼妥珠單抗不同給藥時間對人肺腺癌A549、Calu-6細胞放射增敏作用的研究.pdf

1、目的:探討EGFR單克隆抗體尼妥珠單抗不同給藥時間聯合放射線對人肺腺癌A549、Calu-6細胞放射增敏效應的影響,明確尼妥珠單抗聯合放療的最佳給藥時間,觀察兩種細胞系的實驗結果是否存在差異并探討產生不同結果的可能因為。
　　 方法:體外培養(yǎng)的人肺腺癌A549、Calu-6細胞為研究對象。Western blot檢測兩種細胞系EGFR蛋白的表達。選擇處于對數生長期的細胞,每種細胞系各自分為6個實驗處理組:空白對照組(O組)、單用

2、尼妥珠單抗組(N組)、單獨照射組(R組)、照射前24小時給藥組(N→R組)、照射同時給藥組(NR組)、照射后24小時給藥組(R→N組)。噻唑藍(MTT)比色法分別檢測尼妥珠單抗對兩種細胞的增殖抑制作用,計算各自的IC20和IC50值,選擇IC20值作為后續(xù)實驗的藥物干預濃度?？寺⌒纬蓪嶒灧謩e檢測尼妥珠單抗不同時間給藥對兩種細胞放射增敏的作用并繪制細胞存活曲線。流式細胞儀(FCM)檢測各組的細胞周期分布和凋亡指數變化。Western bl

3、ot檢測phospho-DNA-PK,Bcl-2,Bax,P21,Akt和pAkt蛋白的表達。
　　 結果:
　　 1.兩種細胞均存在EGFR蛋白表達,但是表達水平存在差異。.A549細胞的表達水平較Calu-6細胞高。
　　 2.尼妥珠單抗對人肺腺癌A549、Calu-6細胞均具有增殖抑制作用,呈時間劑量依賴性,但對A549細胞的抑制作用更明顯。尼妥珠單抗對A549細胞24小時、48小時、72小時的IC20分別

4、為(1.15±0.18)μg/ml、(0.84±0.05)μg/ml、(0.72±0.35)μg/ml；IC50為分別為(24.78±1.16)μg/ml、(11.08±0.30)μg/ml、(8.99±0.12)μg/ml。尼妥珠單抗對Calu-6細胞24小時、48小時、72小時的IC20分別為(2.45±0.32)μg/ml、(2.31±0.21)μg/ml、(1.06±0.08)μg/ml:IC50為(51.15±1.58)μg/

5、ml、(48.49±0.59)μg/ml、(36.41±0.85)μg/ml。
　　 3.克隆形成實驗結果顯示,A549細胞N→R組、NR組、R→N組的SER分別為2.02、1.50、1.26。尼妥珠單抗無論何時給藥均增強了A549細胞的放射敏感性,但以N→R組的增強作用最為明顯。Calu-6細胞N→R組、NR組、R→N組的SER分別為1.88、1.09、0.97。尼妥珠單抗照射前24小時給藥使Calu-6細胞的放射敏感性明顯增

6、強,照射同時給藥有輕度增強的作用,而照射后24小時給藥對Calu-6細胞的放射敏感性沒有影響。兩種細胞系N→R組的Dq、Do及N(細胞存活曲線的外推值)均明顯低于NR組、R→N組,照射前24小時給藥產生的放射增敏效應最為明顯。
　　 4.細胞周期結果顯示:尼妥珠單抗作用于A549細胞可以使其G1/G0期比例明顯增加；與放射線聯合后,不論何時給藥均可使G2/M期比例增加,這種變化尤以N→R組的表現最為明顯。尼妥珠單抗作用于Calu

7、-6細胞未出現明顯的G1/G0期阻滯；與放射線聯合后,僅N→R組可使G2/M期細胞比例增加。凋亡結果顯示,對于A549細胞,尼妥珠單抗不論何時給藥均可提高放射線誘導的凋亡,但N→R組的凋亡率最高。而對于Calu-6細胞,僅有N→R組提高了放射線誘導的凋亡,NR組、R→N組的凋亡率未見明顯改變。
　　 5.Western blot檢測結果,兩種細胞系的N→R組均顯示Bax、P21蛋白表達最高,而Bcl-2、Phospho-DNA-

8、PK.蛋白表達最低。Calu-6細胞的Akt、pAkt蛋白表達水平均高于A549細胞。兩種細胞系各自實驗組之間的Akt蛋白表達水平無明顯差異。尼妥珠單抗能抑制 A549細胞的pAkt蛋白的表達,而對Calu-6細胞無效:照射均能使兩種細胞的pAkt蛋白表達提高；與R組比較,兩種細胞N→R組的pAkt蛋白表達水平均減至最低。
　　 結論:尼妥珠單抗聯合照射的最佳給藥時間為照射前24小時。相同實驗條件下,兩種細胞系的結果不同,這可能