西維因單鏈抗體基因克隆、表達(dá)及活性分析.pdf

1、本研究從106-107個(gè)分泌西維因抗體的雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用兼并引物分別擴(kuò)增出抗體輕鏈可變區(qū)(VL)和重鏈可變區(qū)(VH)基因，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序鑒定，確定其為小鼠抗體可變區(qū)片段，片段大小分別為324 bp和360 bp。根據(jù)基因序列重新設(shè)計(jì)特異性引物，重疊延伸PCR擴(kuò)增出單鏈抗體(scFv)基因片段，經(jīng)測(cè)序鑒定，片段連接正確，長(zhǎng)度為729 bp。將此scFv與表達(dá)載體pET30a連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒scFv-pE

2、T30a。轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明獲得重組表達(dá)抗體，分子量大小約為33 kDa，但是形成包涵體。采用透析法對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性，并對(duì)復(fù)性條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示最佳復(fù)性時(shí)間為48 h，最佳起始蛋白濃度為200μg/mL，含有精氨酸的復(fù)性液效果最佳。利用親和層析純化scFv，并利用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)其活性，結(jié)果顯示該scFv對(duì)西維因具有良好的親和性和特異性。
　　 為了獲

3、得活性更好的基因工程抗體，本研究還在表達(dá)載體和信號(hào)肽方面探索，期望獲得可溶性重組抗體。本研究重新設(shè)計(jì)引物，從構(gòu)建成功的scFv-pET30a質(zhì)粒中重新擴(kuò)增了scFv，并將其與可溶性表達(dá)載體pET26b進(jìn)行酶切連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在20℃，不同IPTG濃度下，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)12 h，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，0.05 mmol/L IPTG濃度下有少量可溶性表達(dá)，分子量大小約為30 kDa，在此條件下，大量制備可溶性抗

4、體，用親和層析柱純化后，直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這一抗體與復(fù)性抗體相比，在特異性和穩(wěn)定性方面沒(méi)有優(yōu)勢(shì)。
　　 本研究還嘗試了將有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶(OPH)基因信號(hào)肽序列插入scFv-pET26b質(zhì)粒，構(gòu)建了 OPH-scFv-pET26b重組質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在20℃不同IPTG濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)12 h，SDS-PAGE檢測(cè)菌體破碎后的上清液中沒(méi)有可溶性抗體的表達(dá)，重組蛋白形成了包涵體，分子量大小約為